香蕉枯萎病菌拮抗细菌M43发酵条件优化及活性物质分离

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香蕉枯萎病是由尖镰孢菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)侵染引起的破坏维管束导致植株死亡的典型真菌性土传病害,到目前为止还没有找到一种高效的化学药剂来进行防治。本研究以本实验室保存的12株拮抗香蕉枯萎病菌的生防细菌为材料,通过测定其发酵上清液对尖镰孢菌古巴专化型抑制活性,从中筛选出菌株M43作为深入研究的对象,进行了细菌属种鉴定和发酵条件优化的试验,同时对该菌发酵过程中产生的活性物质进行提取分离,为香蕉枯萎病的生物防治提供理论依据。主要研究结果如下:   1、通过16SrDNA序列及形态和生理生化特征的比较分析,将菌株M43鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。   2、从9种枯草芽孢杆菌培养基中筛选出有利于菌株M43产生拮抗物质的基础培养基为牛肉浸膏3g,蛋白胨59、葡萄糖2.5g、双蒸水1000mL;再通过增加无机离子及进一步的组分优化试验,确定菌株M43活性物质产生的最优培养基为牛肉浸膏15g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖16g/L,K2HP043H2O0.1g/L,KH2P0410.40g/L。   3、通过单因素实验,探讨了不同培养条件对菌株M43产生活性物质的影响,确定菌株M43产拮抗物质最佳培养条件为种龄15-18h、温度25℃、初始pH值范围6.5-7.5、接种量25%、摇瓶装液量占摇瓶体积的50%、转速为150rpm。在最优培养基和培养条件下,经过84h的培养,发酵上清液对香蕉枯萎病菌的抑制率为85.48%,较初始培养基在常规培养条件下的抑制率提高了55.14%,为进一步研究发酵上清液中的活性物质奠定了基础。   4、通过4种孢子萌发方法的比较和不同浓度丙酮溶液对孢子萌发的影响试验,建立了微量且快速的活性物质抑菌效果检测方法,即以1%麦芽糖水溶液为负载剂于凹玻片培养12h,丙酮浓度不超过9%,香蕉枯萎病菌孢子萌发率可达85%以上。   5、采用不同极性有机溶剂(石油醚、乙醚、氯仿和乙酸乙酯)萃取菌株M43发酵液中的活性物质,结果表明,乙酸乙酯的萃取物具有强的抑菌活性。采用硅胶柱层析法从乙酸乙酯萃取物中分离得到38个组分,生物活性测定结果显示,组分3、组分4、组分5、组分9、组分10、组分1l、组分13、组分14和组分21有强的抑制镰刀菌孢子萌发的活性。其中组分14的气质(GC-MS)TIC图谱显示了两个主峰,质谱分析表明该二峰可能是1,2-Benzenedicarboxylic acid,butyl2-methylpropyl ester(邻苯二甲酸异丁酯)和Adipic acid,di(oct-4-ylester)(己二酸二-(4’-)辛酯)。组分5和组分9经二次硅胶柱层析后得到的活性流分具有特殊的臭味,抑菌浓度为1μg/mL,GC-MS图谱显示物质为一组碳链上的碳原子为3-6个的短链脂肪酸。其他活性成分的分离与鉴定有待进一步研究。
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