论文部分内容阅读
研究目的：
通过网络药理学、分子对接虚拟筛选、动力学模拟等计算机模拟技术，探究中药复方四逆散治疗IBS的作用机制；以及从中药成分数据库中筛选出抗TRPV1的候选分子，为基于TRPV1为靶标的抗IBS活性抑制剂提供理论基础，进一步说明计算机模拟技术对中药的研发具有重要意义。
研究方法：
1.基于网络药理学探究四逆散治疗肠易激综合征的作用机制
首先使用TCMSP、TCMDatabase@Taiwan等数据库搜索得到四逆散中柴胡、枳实、甘草、白芍的化学成分，对这些成分进行DL、OB、Caco-2筛选和文献挖掘等方法得到活性成分，建立四逆散的活性成分数据库。然后，在PharmMapper检索这些化合物的潜在靶标，然后通过Pubchem、Uniprot对全部的化合物、靶标进行校对，规范其名称。我们通过CooLGeN、GeneCards数据库搜索与IBS相关的基因，建立IBS疾病相关数据库，并将上述得到的四逆散药物成分的靶点和IBS的靶点输入对比，找到共有靶点，获得IBS与四逆散药物成分的共同作用靶点。进一步利用Metascape软件对得到的靶标进行GO富集分析和KEGG通路注释；使用Cytoscape3.3.0软件构建四逆散的“活性成分-靶点-通路”的网络关系图，研究四逆散治疗IBS的分子机制。最后，基于SystemsdockWebSit软件对四逆散中对四逆散的活性成和关键靶点进行分子对接验证。
2.基于中药成分数据库挖掘TRPV1抑制剂分子的计算机虚拟筛选
首先从TCMDatabase@Taiwan数据库中下载小分子配体化合物库，从PDB数据库中下载TRPV1蛋白受体结构；然后用Libdock、LigandFit、CDOCKER、FlexibleDocking四种对接软件进行分子对接，用QikProp模块进行类药性预测，筛选后得到与TRPV1结合较好的分子；最后使用GROMACS软件进行分子动力学模拟，时长30ns，通过结合自由能、RMSD、RMSF、和氨基酸残基作用分解能的计算，测定它们之间的结合亲和力，进而确定潜在的小分子抗TRPV1抑制剂。
研究结果：
1.经过筛选后，最后得到四逆散的活性成分31个，柴胡中14个，白芍中7个，枳实有6个，甘草8个；对应靶标262个，IBS相关基因37个。在GO富集分析中，这些关键靶标显著富集在炎症反应、免疫反应、蛋白激酶活性、表面受体信号通路等生物过程；KEGG通路分析中，这些靶标主要参与经调节信号通路、PPAR信号通路、补体和凝血级联通路、促性腺激素释放激素信号通路、TRP炎症介质通道、血管平滑肌收缩调节通路等6条通路。进一步对网络关系图进行分析，发现四逆散中柴胡皂荚、芍药苷、甘草素、桔皮素、柚皮素、齐墩果酸、甘草宁B、荜澄茄素、山奈酚、异鼠李素等成分的靶点较多，包括E2F1、CaMK、C3、TPRV1、GC、IL10RA、MAP3K3、PRKCD、HABP1等，涉及到炎症、应激、免疫等过程。而通过分子对接验证发现，四逆散的活性成分和靶点具有较好的结合活性。
2.通过从TCMDatabase@Taiwan获取36，064化合物，经过Libdock、LigandFit、CDOCKER、FlexibleDocking、类药性预测，最终得到ZINC03869685、ZINC14728364、ZINC14588672、ZINC05998754、ZINC18847044、ZINC14448883、ZINC85569474、ZINC85510740、ZINC28536729共9个小分子化合物；通过打分函数和成药性参数的综合考虑，选择ZINC05998754、ZINC14588672、ZINC18847044这3个小分子进行动力学模拟，根据RMSD、RMSF、结合自由能计算和氨基酸残基作用分解能的计算，这3个小分子和TRPV1蛋白受体之间有很好的结合作用力，其中，氢键、疏水作用是主要作用力；ASP20、GLY40、ASN60、ASP80、ILE100、GLU120、GLU140是得到的重要氨基酸，及TRPV1的活性位点区域。
结论：
1.通过网络药理学方法可以从分子层面解析四逆散治疗IBS的作用机制，该方法为临床合理用药和实验研究提供理论依据，为中草药研究提供新思路。
2.通过对TCMDatabase@Taiwan天然数据库进行虚拟筛选、分子对接、动力学模拟，最终筛选出ZINC18847044(Prunetin，樱黄素)、ZINC05998754(Rhamnocitrin，鼠李柠檬素)、ZINC14588672(Meletin，槲皮素)3个新型的TRPV1抑制剂分子，该方法对开发产生新型的抗IBS制剂很有帮助，对于其它活性化合物分子的筛选也具有重要的参考价值。
3.本研究提出的计算机模拟技术会促进中医药的发展，为今后的中药研发很大程度上缩小了实验范围，减少巨大的实验经费，也节省了大量的时间。
通过网络药理学、分子对接虚拟筛选、动力学模拟等计算机模拟技术，探究中药复方四逆散治疗IBS的作用机制；以及从中药成分数据库中筛选出抗TRPV1的候选分子，为基于TRPV1为靶标的抗IBS活性抑制剂提供理论基础，进一步说明计算机模拟技术对中药的研发具有重要意义。
研究方法：
1.基于网络药理学探究四逆散治疗肠易激综合征的作用机制
首先使用TCMSP、TCMDatabase@Taiwan等数据库搜索得到四逆散中柴胡、枳实、甘草、白芍的化学成分，对这些成分进行DL、OB、Caco-2筛选和文献挖掘等方法得到活性成分，建立四逆散的活性成分数据库。然后，在PharmMapper检索这些化合物的潜在靶标，然后通过Pubchem、Uniprot对全部的化合物、靶标进行校对，规范其名称。我们通过CooLGeN、GeneCards数据库搜索与IBS相关的基因，建立IBS疾病相关数据库，并将上述得到的四逆散药物成分的靶点和IBS的靶点输入对比，找到共有靶点，获得IBS与四逆散药物成分的共同作用靶点。进一步利用Metascape软件对得到的靶标进行GO富集分析和KEGG通路注释；使用Cytoscape3.3.0软件构建四逆散的“活性成分-靶点-通路”的网络关系图，研究四逆散治疗IBS的分子机制。最后，基于SystemsdockWebSit软件对四逆散中对四逆散的活性成和关键靶点进行分子对接验证。
2.基于中药成分数据库挖掘TRPV1抑制剂分子的计算机虚拟筛选
首先从TCMDatabase@Taiwan数据库中下载小分子配体化合物库，从PDB数据库中下载TRPV1蛋白受体结构；然后用Libdock、LigandFit、CDOCKER、FlexibleDocking四种对接软件进行分子对接，用QikProp模块进行类药性预测，筛选后得到与TRPV1结合较好的分子；最后使用GROMACS软件进行分子动力学模拟，时长30ns，通过结合自由能、RMSD、RMSF、和氨基酸残基作用分解能的计算，测定它们之间的结合亲和力，进而确定潜在的小分子抗TRPV1抑制剂。
研究结果：
1.经过筛选后，最后得到四逆散的活性成分31个，柴胡中14个，白芍中7个，枳实有6个，甘草8个；对应靶标262个，IBS相关基因37个。在GO富集分析中，这些关键靶标显著富集在炎症反应、免疫反应、蛋白激酶活性、表面受体信号通路等生物过程；KEGG通路分析中，这些靶标主要参与经调节信号通路、PPAR信号通路、补体和凝血级联通路、促性腺激素释放激素信号通路、TRP炎症介质通道、血管平滑肌收缩调节通路等6条通路。进一步对网络关系图进行分析，发现四逆散中柴胡皂荚、芍药苷、甘草素、桔皮素、柚皮素、齐墩果酸、甘草宁B、荜澄茄素、山奈酚、异鼠李素等成分的靶点较多，包括E2F1、CaMK、C3、TPRV1、GC、IL10RA、MAP3K3、PRKCD、HABP1等，涉及到炎症、应激、免疫等过程。而通过分子对接验证发现，四逆散的活性成分和靶点具有较好的结合活性。
2.通过从TCMDatabase@Taiwan获取36，064化合物，经过Libdock、LigandFit、CDOCKER、FlexibleDocking、类药性预测，最终得到ZINC03869685、ZINC14728364、ZINC14588672、ZINC05998754、ZINC18847044、ZINC14448883、ZINC85569474、ZINC85510740、ZINC28536729共9个小分子化合物；通过打分函数和成药性参数的综合考虑，选择ZINC05998754、ZINC14588672、ZINC18847044这3个小分子进行动力学模拟，根据RMSD、RMSF、结合自由能计算和氨基酸残基作用分解能的计算，这3个小分子和TRPV1蛋白受体之间有很好的结合作用力，其中，氢键、疏水作用是主要作用力；ASP20、GLY40、ASN60、ASP80、ILE100、GLU120、GLU140是得到的重要氨基酸，及TRPV1的活性位点区域。
结论：
1.通过网络药理学方法可以从分子层面解析四逆散治疗IBS的作用机制，该方法为临床合理用药和实验研究提供理论依据，为中草药研究提供新思路。
2.通过对TCMDatabase@Taiwan天然数据库进行虚拟筛选、分子对接、动力学模拟，最终筛选出ZINC18847044(Prunetin，樱黄素)、ZINC05998754(Rhamnocitrin，鼠李柠檬素)、ZINC14588672(Meletin，槲皮素)3个新型的TRPV1抑制剂分子，该方法对开发产生新型的抗IBS制剂很有帮助，对于其它活性化合物分子的筛选也具有重要的参考价值。
3.本研究提出的计算机模拟技术会促进中医药的发展，为今后的中药研发很大程度上缩小了实验范围，减少巨大的实验经费，也节省了大量的时间。