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目的：
本课题旨探讨在H202诱导的氧化应激状态下Nef对HSC的影响，并从PI3K/AKT信号转导通路方面进行机制研究。
方法：
(1)H2O2对HSC-T6细胞作用的条件摸索
取正常培养的对数生长期HSC-T6细胞，用含FBS高糖培养基稀释3%H2O2至终浓度分别为0、5、10、20、50、100、200μmol/L的H2O2溶液，终体积为200μL，分别培养12、24、48h，通过MTT法检测H2O2对HSC-T6的增殖抑制作用及镜下形态学的观察。
(2)Nef对氧化应激状态下HSC-T6的作用研究
实验随机分为5组：①空白对照组，含血清培养基处理细胞24h，n=5；②H2O2组，终浓度为0.3%的DMSO处理细胞24h，n=5；③Nef(5)组，5μmol/L3%H2O2与5μmol/LNef溶液共处理24h，n=5；④Nef(15)组，5μmol/L3%H2O2与15μmol/LNef溶液共处理24h，n=5；⑤Nef(30)组，5μmol/L3%H2O2与30μmol/LNef溶液共处理24h，n=5。通过1)MTT法检测Nef对氧化应激状态下的HSC-T6增殖活性；2)流式细胞术检测各组细胞ROS水平；3)Hoechst33342/PI荧光双染评估各组细胞的凋亡情况；4)Westernblot评估PI3K、AKT的磷酸化蛋白表达，探究PI3K/AKT信号转导通路在氧化应激状态下Nef对HSC-T6的作用。
结果：
(1)低浓度的H2O2(5、10μmol/L)对HSC-T6的增殖活性具有正向促进作用，其增殖活性随着作用时间延长而增加；高浓度的H2O2(20-200μmol/L)可对HSC-T6的增殖活性呈现剂量依赖性的抑制作用。(2)Nef抑制氧化应激状态下HSC-T6细胞的增殖活性，与H2O2组相比，Nef(15)组和Nef(30)组HSC-T6增殖活性明显降低，且Nef(30)组的抑制作用明显强于Nef(15)组，差异有统计学意义(P＜0.05)。(3)Nef改变H2O2致HSC-T6细胞的形态学，倒置显微镜结果显示与空白对照组相比，H2O2组细胞密度变大，细胞形态皱缩；与H2O2组相比，Nef(15)组和Nef(30)组细胞密度明显变小，呈细长梭形细胞的占比明显增多。(4)Nef降低H2O2致HSC-T6细胞氧化应激水平，Nef可以减少HSC-T6ROS的产生，与H2O2组相比，Nef各浓度组ROS荧光信号强度都减弱，且Nef(15)和Nef(30)组相比Nef(5)组ROS表达降低的更明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。(5)Nef促进H2O2致HSC-T6细胞凋亡，与H2O2组相比，Nef(5)组、Nef(15)组和Nef(30)组HSC-T6细胞凋亡明显增加，且Nef(30)组高于Nef(15)组，凋亡细胞百分比结果差异有统计学意义(P＜0.05)。(6)Nef可以下调PI3K/AKT通路蛋白表达，与H2O2组相比，Nef(5)组、Nef(15)组和Nef(30)组PI3Kp110β、p-AKT的蛋白表达量均降低，且Nef(30)组相比Nef(15)组蛋白表达降低的更明显，差异有统计学意义(P＜0.01)。
结论：
Nef可抑制氧化应激状态下HSC-T6的增殖活性，降低HSC-T6内ROS表达水平，抑制氧化应激，并诱导HSC-T6的凋亡，其机制可能与降低PI3K和p-AKT通路蛋白的表达，阻断PI3K/AKT信号通路有关。本研究可为肝纤维化的治疗提供新的策略，为Nef在氧化应激状态下肝纤维化的应用奠定基础。
本课题旨探讨在H202诱导的氧化应激状态下Nef对HSC的影响，并从PI3K/AKT信号转导通路方面进行机制研究。
方法：
(1)H2O2对HSC-T6细胞作用的条件摸索
取正常培养的对数生长期HSC-T6细胞，用含FBS高糖培养基稀释3%H2O2至终浓度分别为0、5、10、20、50、100、200μmol/L的H2O2溶液，终体积为200μL，分别培养12、24、48h，通过MTT法检测H2O2对HSC-T6的增殖抑制作用及镜下形态学的观察。
(2)Nef对氧化应激状态下HSC-T6的作用研究
实验随机分为5组：①空白对照组，含血清培养基处理细胞24h，n=5；②H2O2组，终浓度为0.3%的DMSO处理细胞24h，n=5；③Nef(5)组，5μmol/L3%H2O2与5μmol/LNef溶液共处理24h，n=5；④Nef(15)组，5μmol/L3%H2O2与15μmol/LNef溶液共处理24h，n=5；⑤Nef(30)组，5μmol/L3%H2O2与30μmol/LNef溶液共处理24h，n=5。通过1)MTT法检测Nef对氧化应激状态下的HSC-T6增殖活性；2)流式细胞术检测各组细胞ROS水平；3)Hoechst33342/PI荧光双染评估各组细胞的凋亡情况；4)Westernblot评估PI3K、AKT的磷酸化蛋白表达，探究PI3K/AKT信号转导通路在氧化应激状态下Nef对HSC-T6的作用。
结果：
(1)低浓度的H2O2(5、10μmol/L)对HSC-T6的增殖活性具有正向促进作用，其增殖活性随着作用时间延长而增加；高浓度的H2O2(20-200μmol/L)可对HSC-T6的增殖活性呈现剂量依赖性的抑制作用。(2)Nef抑制氧化应激状态下HSC-T6细胞的增殖活性，与H2O2组相比，Nef(15)组和Nef(30)组HSC-T6增殖活性明显降低，且Nef(30)组的抑制作用明显强于Nef(15)组，差异有统计学意义(P＜0.05)。(3)Nef改变H2O2致HSC-T6细胞的形态学，倒置显微镜结果显示与空白对照组相比，H2O2组细胞密度变大，细胞形态皱缩；与H2O2组相比，Nef(15)组和Nef(30)组细胞密度明显变小，呈细长梭形细胞的占比明显增多。(4)Nef降低H2O2致HSC-T6细胞氧化应激水平，Nef可以减少HSC-T6ROS的产生，与H2O2组相比，Nef各浓度组ROS荧光信号强度都减弱，且Nef(15)和Nef(30)组相比Nef(5)组ROS表达降低的更明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。(5)Nef促进H2O2致HSC-T6细胞凋亡，与H2O2组相比，Nef(5)组、Nef(15)组和Nef(30)组HSC-T6细胞凋亡明显增加，且Nef(30)组高于Nef(15)组，凋亡细胞百分比结果差异有统计学意义(P＜0.05)。(6)Nef可以下调PI3K/AKT通路蛋白表达，与H2O2组相比，Nef(5)组、Nef(15)组和Nef(30)组PI3Kp110β、p-AKT的蛋白表达量均降低，且Nef(30)组相比Nef(15)组蛋白表达降低的更明显，差异有统计学意义(P＜0.01)。
结论：
Nef可抑制氧化应激状态下HSC-T6的增殖活性，降低HSC-T6内ROS表达水平，抑制氧化应激，并诱导HSC-T6的凋亡，其机制可能与降低PI3K和p-AKT通路蛋白的表达，阻断PI3K/AKT信号通路有关。本研究可为肝纤维化的治疗提供新的策略，为Nef在氧化应激状态下肝纤维化的应用奠定基础。