【摘 要】
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目的:本课题主要在于评价两类不同的微管蛋白抑制剂:新型荜茇酰胺类微管蛋白抑制剂和基于PROTAC策略合成的微管蛋白降解剂的抗肿瘤活性,并深入探索抗肿瘤机制。方法:1.采用SRB实验和CCK-8实验评估系列化合物抗增殖活性,根据IC50值初步筛选出活性最强的化合物以及对该化合物最敏感的细胞系。2.利用免疫荧光实验、体外微管蛋白聚合实验检测目标化合物对微管及微管蛋白的抑制作用和靶向性;对于降解剂,采用
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目的:本课题主要在于评价两类不同的微管蛋白抑制剂:新型荜茇酰胺类微管蛋白抑制剂和基于PROTAC策略合成的微管蛋白降解剂的抗肿瘤活性,并深入探索抗肿瘤机制。方法:1.采用SRB实验和CCK-8实验评估系列化合物抗增殖活性,根据IC50值初步筛选出活性最强的化合物以及对该化合物最敏感的细胞系。2.利用免疫荧光实验、体外微管蛋白聚合实验检测目标化合物对微管及微管蛋白的抑制作用和靶向性;对于降解剂,采用配体竞争结合实验,CO-IP实验检测目标化合物引起的微管蛋白降解是否是基于PROTAC技术。3.结合流式细胞术探究目标化合物对肿瘤细胞周期、凋亡、ROS、JC-1的影响;Western blotting技术进一步探究目标化合物作用后细胞周期、凋亡、DNA损伤相关信号传导通路蛋白的变化。4.采用细胞迁移,Transwell细胞侵袭,体外小管生成实验,检测目标化合物对目的肿瘤细胞迁移,侵袭,以及体外血管新生的抑制能力。结合Western blotting实验进一步探究目标化合物对侵袭关键蛋白FAK、MMP-9,迁移信号通路ERK/EMT,血管生成通路VEGRF2/PI3K/AKT/MERK的影响。5.借助斑马鱼血管新生实验检测化合物体内抑制血管新生的影响,采用斑马鱼异种移植瘤模型检测化合物体内的抗肿瘤活性。结果:1.II-10b体外显著抑制微管蛋白聚合(IC50:5.8μM),具有微管蛋白靶向性,并对MCF-7/Taxol（紫杉醇耐药）细胞具有高选择性,但同样剂量下对正常细胞无毒性。通过调控线粒体凋亡通路,显著提升γ-H2AX蛋白表达水平并诱导DNA损伤,进而诱发MGC-803细胞的凋亡。2.II-10b可通过抑制FAK、MMP-9的水平,阻断ERK/EMT途径抑制MGC-803细胞侵袭,迁移进程。通过VEGFR2/PI3K/AKT/MERK途径抑制HUVEC细胞的迁移、侵袭及小管形成能力。3.体内研究发现,II-10b能显著抑制斑马鱼血管新生,并具有良好的斑马鱼异种移植瘤抑制作用。4.在A549和A549/Taxol细胞中,α/β/β3-tubulin以复合物的形式存在,W13通过与泛素E3连接酶结合将α/β/β3-tubulin复合物进行泛素化标记,经蛋白酶体系统介导微管蛋白降解。5.W13(IC50:4～21 n M)通过破坏微管网结构将肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期,通过调控Caspase级联信号、诱导DNA损伤诱发肿瘤细胞凋亡;且以浓度依赖性的方式抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭,并具备体外抗血管新生的潜力。结论:本课题通过评价一系列微管蛋白抗肿瘤药物,得到两个具有优越抗肿瘤活性的小分子化合物:荜茇酰胺类衍生物II-10b和微管蛋白降解剂W13,这两种有效抗肿瘤化合物的发现为靶向微管蛋白的小分子药物的研发提供新思路,也为抗肿瘤治疗提供新方向,具有显著的科学意义和临床价值。
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