【摘 要】
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扩展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是苹果贮藏和运输过程的主要病害之一,给苹果产业带来巨大的经济损失。P.expansum的次级代谢产物之一的展青霉素具有多种毒性,广泛存在于苹果及其制品中,长期食用受展青霉素污染的食物将会危害人类身体健康。日常生活中,苹果的贮藏一般为常温和冷藏两种模式,但P.expansum可生长的温度范围广,-6℃～35℃下都可生长。目前不同温度下P
【基金项目】
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国家重点研发计划课题二“真菌毒素在食品原料中的代谢转化及控制机理”（课题编号:2019YFC1604502）,课题主持人:王成研究员（新疆农业科学院）；
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扩展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是苹果贮藏和运输过程的主要病害之一,给苹果产业带来巨大的经济损失。P.expansum的次级代谢产物之一的展青霉素具有多种毒性,广泛存在于苹果及其制品中,长期食用受展青霉素污染的食物将会危害人类身体健康。日常生活中,苹果的贮藏一般为常温和冷藏两种模式,但P.expansum可生长的温度范围广,-6℃～35℃下都可生长。目前不同温度下P.expansum在苹果中侵染、迁移规律以及P.expansum侵染苹果后代谢变化还未明确。因此本文以P.expansum和苹果为试材,首先利用叠氮溴化丙锭（Propidium Monoazide,PMA）与实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction,qPCR）技术建立的快速检测P.expansum活菌方法来探究P.expansum的迁移规律,再通过病斑直径、毒素、展青霉素合成相关基因检测探究不同温度下P.expansum及毒素迁移规律,利用代谢组学技术对不同温度下P.expansum侵染苹果后代谢变化进行初步研究,本文研究结果如下:（1）通过优化PMA处理浓度、黑暗孵育及曝光时间,筛选P.expansum特异性引物,结合qPCR技术,建立一种基于PMA-qPCR联用快速检测P.expansum活菌的方法,最终发现PMA处理浓度10μg/mL、黑暗孵育5 min、曝光10 min为最佳PMA处理条件。4种引物中Pexp-pat F对P.expansum具有极强的特异性,可作为引物用于PMA-qPCR检测。构建的定量标准曲线的R~2=0.9948,最低检测限为102.6 CFU/mL,方法检测结果与平板菌落计数无明显差异,并发现在苹果的未腐烂部分中可检测出P.expansum活菌,说明P.expansum会向苹果健康组织迁移。（2）在苹果上人工接种P.expansum,放置常温或冷藏（4℃～8℃）下培养。利用高效液相色谱检测展青霉素含量,发现冷藏31 d的病斑直径与常温9 d的一致,但是前者展青霉素的含量是后者的16倍,同时在距离病斑0.5 cm处检测出展青霉素,含量达到病斑处10%,为7.99μg/g,超出最低国家标准限量值;通过检测常温下展青霉素合成相关基因PatK、PatJ相对表达量并跟展青霉素含量进行相关性分析,发现展青霉素合成相关基因PatK、PatJ表达与展青霉素含量显著相关,在常温培养11 d病斑以外的部位发现展青霉素合成相关基因PatK、PatJ的表达,并与距离病斑的距离成反比。结果说明冷藏培养能够延迟P.expansum的生长速度,但不能阻止展青霉素的合成,只会延迟和增加展青霉素含量的累积。同时展青霉素会向苹果健康组织的迁移。（3）利用代谢组学技术对未处理、刺伤、接种P.expansum后常温贮藏7 d的苹果进行代谢组学研究,发现接种组病斑处共检测出75个显著差异物,12条代谢通路发生显著变化。其中接种组病斑处的类黄酮生物合成通路整体趋势上调,ABC转运蛋白途径混乱,这可能与P.expansum侵染后果实细胞膜转运受到损害和植物防御反应有关;距离病斑0.5、1、2、3 cm处的果肉组织的差异产物数量与病斑距离成反比,且上调的差异代谢物越多,其中距离病斑2 cm以内组织中黄酮类代谢物的生物合成通路整体趋势上调,说明P.expansum侵染苹果培养7 d后可能会使距离病斑2 cm以内果实组织中分泌黄酮类物质来防御P.expansum的侵染。（4）利用代谢组学技术检测并对比分析了不同温度培养下病变直径相同的染病苹果（分别在室温培养7 d和冷藏24 d）的代谢物,相比于常温7 d培养,冷藏24 d培养下共检测到83个显著差异代谢物,其中包括有机酸类代谢物、脂类代谢物、黄酮类代谢物等66个代谢物在冷藏培养中相对下调,展青霉素、葡萄糖酸、甜菜碱等17个代谢物相对上调。差异代谢物共参与31条代谢途径,其中类黄酮生物合成、丙酮酸代谢、磷酸戊糖途径、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成等7条代谢通路差异显著。冷藏培养下葡萄糖酸内酯、葡萄糖酸2种代谢物含量同展青霉素含量一样显著高于常温培养,猜测展青霉素含量的积累与葡萄糖酸等物质的代谢有关。
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