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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和无乳链球菌(Strptococus agalactiae)是引起奶牛乳房炎的主要致病菌。本研究应用SYBR Green-I实时荧光PCR技术建立针对以上细菌的单重和多重快速诊断方法。单重诊断方法:根据金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌rrnB基因和无乳链球菌tuf基因的核酸序列设计特异引物。扩增产物经克隆测序后,将阳性重组质粒进行浓度梯度稀释,以稀释得到的重组质粒作为模板标准品建立3种病原菌的检测标准曲线:金黄色葡萄球菌y=-3.415x+14.02,R2=0.996;大肠杆菌 y=-3.498x+9.2777,R2=0.999;无乳链球菌y=-3.298x+10.37,R2=0.998。扩增效率分别为:96.3%,93.1%和 101.0%。该方法可检测的最低浓度分别为6.08×103copies/μl、7.18×103 copies/μl和5.30×103 copies/μl。经融解曲线分析,特异性良好,无非特异性扩增。重复性试验表明,金黄色葡萄球菌3个浓度标准品的批内变异系数分别为1.56%、0.78%和1.77%,批间变异系数分别为1.53%、2.26%和2.57%;大肠杆菌批内的分别为1.56%、1.52%和2.46%,批间的分别为3.04%、1.45%和3.75%,无乳链球菌批内的分别为2.74%、1.89%和0.98%,批间的分别为3.02%、1.97%和1.93%。以上结果表明,3种致病菌单重SYBR Green-I荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。多重诊断方法:在上述单重荧光定量PCR的基础上,利用三种病菌扩增产物不同的TM值,进行多重定性分析。融解曲线结果表明,金黄色葡萄球菌TM值为79.3-80.3、大肠杆菌为85.1-86.1、无乳链球菌为81.6-82.6;可以同时检测3种病原菌。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌有特异性的峰值出现,无非特异性扩增。三种病原菌多重检测的最低浓度低于单重检测结果。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌的TM值重复试验的批内变异系数分别为:0.1%、0.09%和0.08%,批间变异系数分别为:0.30%、0.44%和0.43%。结果表明,3种致病菌的多重SYBR Green-I实时荧光定性PCR方法具有较好的特异性、敏感性和重复性。结论:本研究成功建立了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌单菌的SYBR Green-I实时荧光定量PCR方法及多重SYBR Green-I实时荧光定性PCR方法,可以对这3种病原菌进行定量或定性的快速检测。