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第一部分人脐带间充质干细胞体外分离、培养与生物学特性目的：体外分离、培养扩增人脐带Wharton胶来源的间充质干细胞，并通过流式细胞仪及多向诱导分化对其干细胞特性进行鉴定。方法：取8例足月健康剖宫产新生儿脐带标本，采用0.075%的Ⅰ型胶原酶消化法结合反复贴壁法分离培养并纯化人脐带间充质干细胞；倒置显微镜下观察干细胞的形态变化，流式细胞仪检测干细胞表型分子。利用成骨、成脂肪及成软骨诱导剂诱导人脐带间充质干细胞定向成骨、成脂肪及成软骨分化，诱导21天后采用茜素红S染色、油红O染色、阿利新蓝染色及II型胶原免疫组织化学染色法检测其定向分化情况。结果：应用0.075%的Ⅰ型胶原酶37℃消化10-16小时可分离出较多的人脐带间充质干细胞。原代人脐带间充质干细胞平均3天贴壁，达到80%融合约需2周；初始形态呈不规则多角形，传至3代后，转变成较均一的长梭形，并呈漩涡状排列。流式细胞仪检测分析发现人脐带间充质干细胞高表达CD90、CD105、CD44分子，低表达CD34、CD45分子及HLA-DR。多向诱导21天后，茜素红S染色、油红O染色、阿利新蓝染色及II型胶原免疫组织化学染色均呈阳性。结论：通过Ⅰ型胶原酶消化结合反复贴壁法可获得人脐带间充质干细胞，该细胞体外具有多向分化潜能。第二部分温敏型壳聚糖支架的构建及其生物相容性目的：研究壳聚糖盐酸盐与β-甘油磷酸钠不同浓度配比对水凝胶性能的影响，探寻适合构建椎间盘组织工程支架的可注射凝胶体系，并评价其生物相容性。方法：制备不同浓度配比的壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶，壳聚糖盐酸盐的终浓度分别为3%、2%、1%，β-甘油磷酸钠的终浓度则分别为0.25M、0.5M、0.75M；pH酸度计检测液态水凝胶pH值，并评价不同环境温度对其pH值的影响；恒温水浴箱内测定其37℃下凝胶化时间；肉眼观并参照凝胶形态评分表进行凝胶形态评分；HE染色、Masson染色及扫描电镜观察凝胶的形貌结构；CCK-8检测3种β-甘油磷酸钠浓度的凝胶浸提液的细胞毒性，并绘制生长曲线；倒置显微镜观察结合DAPI染色检测凝胶膜的细胞粘附性能；扫描电镜观察细胞/支架复合物的形态；将凝胶植入小鼠皮下，解剖肉眼观及HE染色观察其体内相容性与降解性。结果：壳聚糖盐酸盐及β-甘油磷酸钠的浓度配比对水凝胶的pH值、37℃凝胶化时间及凝胶形态等有较大影响，环境温度及高压灭菌处理等对水凝胶的pH值及温敏特性无明显影响。其中2%壳聚糖盐酸盐/0.5M β-甘油磷酸钠的水凝胶pH值7.04，37℃凝胶化时间8.5分钟，凝胶形态良好。HE染色及扫描电镜等显示固态凝胶为形状不规则的疏松多孔网络结构，细胞呈类圆形位于支架网络结构中，并粘于支架上。浸提液细胞毒性检测表明0.5Mβ-甘油磷酸钠的凝胶有利于细胞生长。显微镜观察结合DAPI染色显示人脐带间充质干细胞能较好地粘附在凝胶膜上。体内实验表明该支架注射入体内后在原位凝胶化，注射部位无明显炎症反应，接种4周后，支架部分吸收，无明显炎细胞浸润和异物反应。结论：材料的浓度配比对壳聚糖水凝胶的温敏特性及生物相容性有较大影响；壳聚糖水凝胶在椎间盘组织工程细胞支架的构建中具有潜在的用途。第三部分人脐带间充质干细胞在温敏型壳聚糖支架上向类髓核细胞分化的生物学效应目的：将人脐带间充质干细胞种植于温敏型壳聚糖支架上进行三维培养，检测三维培养后人脐带间充质干细胞向类髓核细胞分化的生物学变化。方法：采用2%壳聚糖盐酸盐/0.5M β-甘油磷酸钠水凝胶，制备人脐带间充质干细胞/壳聚糖支架复合物并种植于24孔板上，常规培养2周、4周；HE染色、Masson染色观察三维培养后细胞/支架复合物的形态特征；real time PCR检测三维培养后人脐带间充质干细胞Ⅱ型胶原、Aggrecan及SOX-9等类髓核相关基因的表达情况；II型胶原、Aggrecan免疫荧光染色定性观察细胞基质合成情况。结果：HE染色、Masson染色显示支架疏松多孔的网络结构中细胞呈类圆形并有聚集现象，细胞位于支架陷窝样结构中；定量real time PCR检测提示SOX-9、Aggrecan及II型胶原在复合培养2周后基因表达明显上调（P<0.05），复合培养4周，基因表达进一步上调（P<0.05），而I型胶原的基因表达无明显统计学差异；免疫荧光检测提示复合培养2周后可见Aggrecan及II型胶原蛋白合成，培养4周后其合成量有进一步增加。结论：人脐带间充质干细胞在壳聚糖支架上能向类髓核细胞分化；人脐带间充质干细胞与温敏型壳聚糖支架在组织工程髓核的构建中具有潜在的用途，有希望在IDD的微创治疗方面发挥潜在临床价值。