猪链球菌是一种新发的人兽共患病病原，可以引起猪脑膜炎、脓毒症，也能引起人脑膜炎和中毒休克样综合征。猪链球菌是引起成人链球菌脑膜炎的第二大病因，仅次于肺炎链球菌。在已鉴定的35种血清型中，猪链球菌血清2型是最主要的致病菌株。但是，猪链球菌血清2型引起脑膜炎的分子机理还不清楚。　　细菌粘附素分子和宿主细胞表面受体介导的细菌粘附在猪链球菌脑膜炎中发挥着关键作用。研究表明猪链球菌粘附素Fhb可以与宿主细胞表面的糖脂分子GbO3结合。我们课题组发现，Fhb是引起猪链球菌脑膜炎的重要毒力因子。Fhb能激活TGF-β信号通路，下调claudin-5的表达，增强血脑屏障的通透性，促使猪链球菌穿过血脑屏障。我们实验室证实GbO3参与Fhb介导的猪链球菌与人脑微血管内皮细胞粘附和穿血脑屏障过程。但是Fhb如何特异性的识别受体GbO3的结构机理尚不清楚。　　此外，Fhb在猪链球菌血中存活和逃避补体介导的宿主天然免疫中发挥着重要作用。Fhb通过招募人补体调节因子factor H，协助factor I降解沉积在猪链球菌表面的补体成分C3b，从而抑制补体介导的调理吞噬作用。Fhb还能与补体成分C3b和C3d直接结合。但是，Fhb结合多种血清成分的结构基础还不清楚。本研究运用结构生物学手段解析了Fhb以及Fhb与受体Gb2复合物的结构，解释了Fhb识别受体Gb3的结构机理，并发现了Fhb与多种血清成分结合的结构基础。　　本文第一部分是Fhb蛋白的表达纯化以及结晶筛选和优化。生物信息学分析表明Fhb由二级结构丰富的N端和无规卷曲组成的C端组成。先前的研究表明Fhb与受体相互作用的区域为N端。因此，我们表达了45-344aa的片段N-Fhb，并利用Ni2+柱和分子筛纯化了N-Fhb，然后利用晶体筛选工具盒进行了结晶筛选和优化，获得了一套分辨率2.33的数据。纯化和结晶的过程中，我们发现N-Fhb存在降解。蛋白印迹和蛋白N端测序显示N-Fhb降解的位点是K139。因此，我们又表达了Fhb从139-343aa的片段Fhb RBD，然后进行了纯化、结晶筛选和优化，获得一套分辨率1.65的衍射数据。由于Fhb RBD没有同源结构，无法通过MR法来解析结构。我们利用大肠杆菌B834菌株表达了Fhb RBD硒代蛋白，然后纯化和结晶硒带蛋白，最终收集到了一套分辨率1.5的衍射数据。　　本文第二部分是 Fhb和Fhb与 Gb2复合物的结构解析。利用 SAD法解析N-Fhb结构时，发现反常散射信号太弱，无法解析结构。通过用B834菌株表达Fhb RBD，提高Se原子替代率，增强反常散射信号和提高信噪比，最终采用SAD法解析了Fhb RBD的结构。以Fhb RBD的结构为模型，采用 MR法解析了Fhb RBD与Gb2复合物的结构。　　本文第三部分分析了Fhb RBD和Fhb RBD与Gb2复合物的结构，阐明Fhb识别Gb2的结构机理，解释 Fhb招募多种血清成分的结构基础。Fhb RBD是由一个典型的β三明治核心和外侧的3个α螺旋组成。受体Gb2结合在Fhb表面一个凹陷的口袋中。Fhb与Gb2结合主要由氢键和疏水作用介导。对于α-Gal， Y198与6-OH形成氢键，Q255与6-OH和O-5形成氢键，R238与4-OH，N285和G233与3-OH形成氢键。对于β-Gal，K316与2-OH和3-OH形成氢键，E327与2-OH形成氢键。Y198，F283，F318与α-Gal的非极性面形成疏水接触作用， W258与β-Gal的非极性面形成疏水作用。ITC测定了与受体结合相关氨基酸突变体与Gb2的亲和力，突变体蛋白与Gb2的结合能力显著下降。Fhb的天然受体是Gb3和Gb4，但Fhb对两者结合能力差别很大。通过结构模拟，我们解释了Fhb对Gb3和Gb4结合能力的差异。氨基酸组成分析表明N-Fhb富含带电的氨基酸，尤其是带负电的氨基酸。表面电荷分布分析也表明，Fhb RBD表面有大片的负电荷集中区和正电荷集中区。不同factor H结合蛋白序列和结构同源度都很低。但是已解析结构的3个factor H结合蛋白表面都有比较大面积的负电荷集中区，而且已被证实主要通过表面带负电的氨基酸与factor H结合。我们推测Fhb也是通过表面负电荷集中区与factor H结合。目前已经解析结构的多种金黄色葡萄球菌C3d结合蛋白表面都有大面积的正电荷集中区，而C3d表面有大面积的负电荷集中区，两者通过电荷互作结合。我们推测 Fhb也通过电荷互作与C3d结合。C3d是C3b的一个降解片段，Fhb应该通过电荷互作与C3b结合。　　本文第四部分解析了另外一个功能未知的猪链球菌毒力因子1083蛋白的结构。通过序列和结构比对，我们推测1083是一个嘌呤核苷外周结合蛋白，可能参与猪链球菌核苷或核苷酸运输。　　综上所述，本研究利用结构生物学手段解析了Fhb RBD和Fhb RBD与Gb2复合物的结构，鉴别出Fhb与Gb2结合相关的关键氨基酸残基。表面电荷分布表明Fhb分别通过表面的负电荷和正电荷集中区与Factor H和C3d结合。Fhb与Gb2复合物结构的解析将促进猪链球菌抗粘附素药物的开发。