研究发现猪瘟病毒不是对猪的所有体细胞都有致细胞病变作用(CPE),而只是对与CSFV具有高度亲和力的细胞有CPE的作用。位于病毒粒子表面的E2蛋白在病毒感染进入细胞的过程中,可与宿主细胞表面的E2特异性受体相互作用,从而介导病毒进入细胞中,用一定浓度的E2蛋白可完全阻断CSFV对体外培养细胞的感染过程。因此,E2蛋白对病毒感染细胞进而增殖引起细胞病变具有重要作用。研究表明猪瘟病毒引起猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)发生CPE的原因可能是猪血管内皮细胞被猪瘟病毒感染后刺激某种/某些敏感基因,表达了某种/某些蛋白酶,将猪瘟病毒的p125蛋白裂解成为p80蛋白所致。本研究将猪瘟病毒在血管内皮细胞上多次传代后,采用分子生物学方法和软件分析猪瘟病毒E2基因的遗传变异情况,同时在前期工作的基础上,从4个敏感基因中选出了Y8基因,将其转入PK-15细胞中,为其基因功能及猪瘟病毒致病机理的研究奠定了基础。1.无菌采取猪脐带,分离脐静脉,用胶原酶消化分离内皮细胞,于37℃、5%的CO2条件下培养。培养的细胞为单层贴壁生长,呈铺路石状。待原代细胞铺满80%左右,接种猪瘟石门株脾毒,待细胞铺满后将细胞传代,并收集每代细胞。结果原代的猪血管内皮细胞接毒后,经2次传代,细胞开始有空泡样病变,经3次传代,细胞脱落死亡。2.收集每代细胞毒,提取猪瘟病毒RNA,用E2基因特异性引物进行RT-PCR,得到目的基因E2,连接到载体pMD18-T上,得到重组质粒pMD18-T-E2,进行核苷酸测序。结果表明,目的基因插入方向、大小、位置、读码框及核苷酸序列均正确,得到了重组质粒pMD18-T-E2。用DNA Star软件分析结果表明,各代细胞CSFV之间的核苷酸同源性为99.4%～99.9%,氨基酸的同源性为98.9%～99.8%,各代细胞病毒与标准猪瘟病毒石门株的核苷酸的同源性为98.9%～99.3%,氨基酸的同源性为98.9%～99.2%。3.利用特异性引物扩增出Y8基因,连接到T载体上,经鉴定后与表达载体pEGFP-C1连接,得到重组质粒pEGFP-Y8。将纯化后的重组载体和空载体pEGFP-C1转染PK-15细胞,由最佳G418浓度抗性筛选14d后获得阳性细胞,得到了2株能持久转录Y8基因的PK-15细胞株和1株能持久转录pEGFP-C1的PK-15细胞株。