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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是一类能形成芽胞的革兰氏阳性细菌,因其能产生多种活性物质而被广泛地应用于生物杀虫剂的研发及用作转基因作物的基因来源。苏云金素（thuringiensin,Thu）是一种小分子量的核苷类活性物质,由某些Bt菌株产生并分泌至胞外,对多种昆虫、线虫和螨类等有毒杀作用。Thu的结构由腺苷、阿洛糖二酸、葡萄糖和磷酸按照1:1:1:1的比例组成,分子式是C22H32O19N5P,分子量是701 Da。前期本实验室在Bt菌株CT-43中分析、鉴定了Thu的生物合成基因簇,并推导了其合成途径。其中关键基因有5个,S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因thu1、磷酸激酶基因thu E、糖基转移酶基因thu F、转运蛋白基因thu T和非核糖体肽合成酶基因thu2。前期的敲除实验显示这5个基因均是苏云金素产生所必须的。体外催化实验证实了磷酸激酶Thu E能够将未磷酸化的苏云金素前体物C磷酸化为成熟的苏云金素,负责苏云金素合成的最后一步。苏云金素需要被分泌至胞外发挥作用,但其分泌机制目前仍不清楚。对其生物合成基因簇进行分析发现,只有一个与转运相关的基因thu T（major facilitater superfamily）,推测可能与苏云金素的分泌相关。另外,由于在CT-43胞内未检测到已磷酸化的成熟的苏云金素,因此我们推测前体物C是在跨膜转运的过程中磷酸化为苏云金素的。通过一系列实验初步证实推测并得到以下结论:1.证明了Thu T是与转运相关的膜蛋白。a.thu T基因与苏云金素的产生相关。选取12h和24 h两个时间点,分别通过RT-PCR及HPLC分析,发现菌株CT-43中thu T基因转录量的变化与苏云金素产量的变化一致。b.thu T基因是苏云金素产生的必须基因。对thu T基因缺失突变株BMB1754进行质谱检测,发现苏云金素的产量与野生菌株CT-43相比减少了95%左右;对BMB1754进行thu T基因的回补,能够恢复苏云金素的产生,证实突变株BMB1754中苏云金素的产量大幅度下降是由该基因的缺失引起的。c.Thu T是膜蛋白。序列分析显示Thu T含有十个跨膜结构域,利用绿色荧光蛋白标记,通过荧光显微镜观察到Thu T定位于细胞膜,对提取的重组菌株的细胞膜蛋白和细胞质蛋白用Western blot的方法证明了Thu T为膜蛋白。2.发现Thu T与Thu E协同作用完成苏云金素的成熟与分泌。a.thu T基因的缺失影响Thu E的功能。通过质谱检测,观察到thu T基因的缺失突变株BMB1754胞内苏云金素未累积,而前体物C发生了大量累积,表明thu T基因的缺失使前体物C未磷酸化为苏云金素而发生积累,磷酸化是由Thu E蛋白催化的,因此thu T基因的缺失影响到Thu E蛋白的功能。b.Thu T与Thu E存在相互作用。基于thu T基因的缺失影响Thu E的功能,我们推测与苏云金素转运相关的Thu T与负责苏云金素成熟的Thu E之间存在相互作用,并利用Ligand blot杂交的方法证明了这一推测。c.Thu E依赖于Thu T定位于细胞膜附近。通过序列分析发现Thu E不存在信号肽及跨膜结构域,最有可能定位于细胞质。通过GFP标记检测到Thu E蛋白在不存在Thu T蛋白的情况下荧光呈现较为分散、亮度较弱的状态,而Thu E蛋白在Thu T蛋白存在的情况下则荧光分布较为集中,且与Thu T蛋白的定位很相似,表明Thu E蛋白依赖于Thu T蛋白定位于细胞膜附近。根据目前得到的结果,我们提出了苏云金素成熟与分泌的模型,磷酸激酶Thu E与膜蛋白Thu T相互作用使Thu E定位于细胞膜上的Thu T附近,从而前体物C磷酸化为成熟的苏云金素后迅速将苏云金素分泌至细胞外。苏云金素的分泌是将磷酸化与转运相偶联的新型转运方式。另外,我们还对苏云金芽胞杆菌产生的细菌素进行初步的研究。细菌素是一类由细菌产生的,核糖体合成的多肽,对其它细菌有活性,且产生菌有特异性的免疫机制来保护自身免受毒害。其高活性、低毒、易于遗传操作等特点使其在食品、医药等行业表现出良好应用前景。通过大量分析Bt菌株基因组,预测到多个不同类型的新颖的细菌素合成基因簇,本研究对其中某些合成基因簇的合成功能展开研究。3.Thi I负责B.thuringiensis T01001对细菌素thuricin 4A-4的免疫。通过生物信息学分析,在B.thuringiensis T01001菌株中找到了一个新型的羊毛硫类细菌素合成基因簇thuricin 4A。基因thi I比对的相似度很低,它编码一个含有5个跨膜结构域的膜蛋白,推测与T01001对细菌素thuricin 4A-4的免疫相关。我们对thi I基因进行异源表达,异源表达菌株BMB2108与出发菌株BMB171相比,对细菌素thuricin 4A-4的抗性提高了4倍,证明了Thi I蛋白的免疫功能。4.Sactipeptide类细菌素thuricin 4CE1生物合成基因簇的验证。Sactipeptide类细菌素是一类翻译后修饰的核糖体合成的多肽,目前仅发现5个成员。在B.thuringiensis 4CE1基因组发现一种新型的sactipeptide类细菌素合成基因簇thuricin4CE1,且该菌株发酵上清对某些特定的革兰氏阳性病原菌有抑菌活性。本研究对该合成基因簇进行了异源表达并证实其具有合成抗菌肽的功能。