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肠道激素不仅可以通过生物节律调控肠道的消化、吸收能力和免疫机制,还能通过影响肠道微生物从而调控宿主。但是目前有关反刍动物瘤胃内激素及其与微生物之间关系的研究鲜有报道。因此,本研究通过泌乳奶牛体内与体外瘤胃内褪黑激素与瘤胃细菌群体结构的变化以及二者的相关关系,探究瘤胃内激素的分泌规律及其对瘤胃细菌种属的影响。试验一、泌乳奶牛瘤胃液褪黑素,生长激素、促乳素的昼夜变化规律探索本部分试验主要探索了泌乳奶牛瘤胃液中褪黑素（MLT）,生长激素（GH）、促乳素（PRL）等浓度的昼夜变化趋势,并分析了与血清、唾液中相应激素的变化关系。选取体重、胎次、泌乳性能等都相似的6头中期泌乳奶牛,分别在02:00、10:00、18:00（1st d）和06:00、14:00、22:00（2nd d）采集血液、唾液和瘤胃液,检测以上三种激素的浓度。结果表明,血清、唾液和瘤胃液中MLT浓度都有明显的昼夜节律,且都较符合Cosine生物钟的变化规律:无光照（Dark）时MLT浓度显著高于有光照（Light）时的MLT浓度（P<0.05）;血清、唾液和瘤胃液中MLT的PCA分析表明瘤胃内MLT来源于血液的可能性大于唾液的可能性;而相关性分析显示只有血清中的MLT与瘤胃液中的MLT存在显著的正相关关系（R=0.34,P=0.042）。另外,血清和瘤胃液中GH不受时间影响（P>0.05）,但是唾液中06:00时GH浓度显著高于02:00、14:00和18:00时的GH浓度（P<0.05）;唾液中PRL浓度不受时间影响（P>0.05）,但不同时间点血清和瘤胃液中的PRL浓度差异显著（P<0.05）,且二者呈现相反的变化趋势。本部分试验结果表明,瘤胃内含有褪黑素,而且其昼夜变化趋势符合生物钟的变化规律,受光照-黑暗周期的影响;瘤胃内同时也会有GH和PRL,但并不呈现昼夜变化趋势。试验二、泌乳奶牛瘤胃发酵参数及其菌群结构的昼夜变化相关性研究本部分试验主要在获得瘤胃MLT具有日节律变化的基础上,进一步探讨泌乳奶牛瘤胃菌群的昼夜变化规律,并筛选与MLT昼夜变化规律相关的微生物。试验方法同试验一,即选取体重、胎次、泌乳性能等都相似的6头中期泌乳奶牛,分别在02:00、10:00、18:00（1st d）和06:00、14:00、22:00（2nd d）采集瘤胃液,测定瘤胃发酵参数并进行16S扩增子测序分析菌群结构。结果表明,Dark和Light时的瘤胃菌群结构具有显著的差异,且Dark时的Shannon指数显著高于Light时的Shannon指数（P<0.05）,符合Cosine生物钟节律（r2=0.933）;而非参数检验JTKCYCLE分析发现瘤胃菌群中4.6%可识别OTU具有显著的昼夜节律（P<0.05）;瘤胃发酵pH值、NH3-N和MCP含量表现出一定的昼夜节律,且NH3-N对瘤胃菌群结构有显著贡献（P<0.05）,MLT和戊酸也对瘤胃菌群结构有明显的贡献。微生物丰度差异分析发现Preteobacteria和Succinivibrionaceae在Dark时的相对丰度显著低于Light时的丰度,而Bacteroidetes和Prevotellaceae的相对丰度都在Dark时显著高于Light时（P<0.05）;OTU1、OTU2823、OTU2330（都为unidentified Succinivibrionaceae）和OTU48（Prevotellaceae科）、OTU157（undentified Prevotellaceae）对菌群结构有重要的影响,且OTU1、OTU2823、OTU2330相对丰度的昼夜规律与瘤胃MLT昼夜规律相反,而OTU48和OTU157相对丰度昼夜变化规律与瘤胃MLT昼夜变化规律一致。本部分试验结果表明,部分瘤胃细菌及其发酵参数也具有昼夜节律,且光暗或者MLT对Prevotellaceae和Succinivibrionaceae科的相对丰度有显著影响。其中,Succinivibrionaceae科相对丰度昼夜规律与MLT昼夜规律相反,而Prevotellaceae科相对丰度昼夜规律与MLT昼夜规律一致。试验三、褪黑素对体外培养瘤胃发酵参数和菌群结构的影响本部分试验旨在通过体外模拟瘤胃发酵技术验证MLT与瘤胃菌群之间的关系。分别设置人工唾液+标准MLT溶液（CK0组）、人工唾液+瘤胃液（CK1组）以及人工唾液+瘤胃液+标准MLT溶液（MLT组）,体外模拟培养24 h,分别于培养0、4、8、12、16、20、24 h采集培养液分析MLT浓度以及CK1和MLT组中的瘤胃发酵参数和瘤胃菌群结构。研究结果表明,培养的时间和处理都对培养液中的MLT浓度有极显著的影响（P<0.01）,且CK1和MLT组褪黑素降解速率比CK0组的快（P<0.05）;CK1组与MLT组菌群α、β多样性以及瘤胃发酵参数差异均不明显,但Shannon指数都在12 h最低,也都符合Cosine生物钟规律（r2分别为0.872和0.910）;菌群差异分析发现 MLT 组的 Bateroidetes、Bacteroidia、Bacteroidiales和Prevotella1丰度显著高于 CK1组（P<0.05）,而 CK1 组中 Kiritimatiellaeota、Kiritimatiellae 和 WCHB141 显著高于MLT组（P<0.05）;随机森林分析CK1和MLT组中大多数能够代表MLT的微生物都属于Bacteroidales,且共同具有代表性的OTU395和OTU365都属于Prevotellaceae。相关性分析表明Prevotellaceae、Prevotella 1与MLT之间存在显著的正相关（P<0.05）,而且MLT显著提高了 Prevotellaceae、Prevotella 1的相对丰度,却降低了Succinivibrionaceae、unidentified Succinivibrionaceae、Ruminobacter和Succinivibrionaceae UCG-002的相对丰度（P<0.05）;菌群功能预测分析中,MLT显著降低了菌群细胞运动和分泌、阿特拉津降解、磷酸代谢以及蛋白质加工等相关功能,而且 Bacteroidetes、Bacteroidia、Bacteroidales、Prevotellaceae、Prevotella 1 和Succinivibrioaceae、unidentified 与这些通路也存在显著的相关关系（P<0.05）。本部分试验结果表明,MLT对体外培养瘤胃菌群α、β多样性没有影响,且瘤胃细菌在体外培养时可能仍然具有生物节律性;MLT对Bacteroidetes有很大的影响,并且能够提高体外培养液中Prevotellaceae的相对丰度,但降低Succinivibrionaceae的相对丰度。综上:1)泌乳奶牛的瘤胃内含有褪黑素,而且其浓度符合昼夜生物节律;瘤胃液中的pH值、氨氮浓度和瘤胃微生物蛋白含量以及4.6瘤胃细菌也具有一定的昼夜节律。2)体外试验表明,培养液中瘤胃菌群及其发酵参数没有受MLT浓度的影响,但是部分瘤胃细菌可能本身就具有生物节律。3)体内、外试验都表明,瘤胃液MLT与Prevotellaceae和Succinivibrionaceae有一定的关系,主要表现为MLT能够提高Prevotellaceae和Prevotella 1 的相对丰度,而降低 Succinivirobrionaceae、unidentified Succinivirobrionaceae、Ruminobacter 和 Succinivirobrionaceae UCG-002 的相对丰度,但其具体的影响机制仍需要进一步研究。4)光暗周期或可通过影响MLT调控Bacteroidetes尤其是Prevotella以及Succinivibrionaceae的丰度进而影响瘤胃菌群的阿特拉津降解、细胞运动和分泌、磷酸代谢、蛋白质折叠、加工以及赖氨酸生物合成等相关功能,最终调节泌乳奶牛的泌乳性能。