血管钙化是多种慢性疾病（包括动脉粥样硬化、糖尿病血管病变、高血压、终末期肾病等）以及机体衰老过程中较为常见的病理变化特征,是心血管不良事件发生风险增加和死亡率升高的独立危险要素。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）是血管壁中层的主要构成,其由正常的收缩表型向成骨样或软骨样细胞表型转变是钙化形成的中心环节,并且VSMC表型转化与细胞整体能量状态密切相关。丙酮酸脱氢酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4）是调节线粒体氧化磷酸化向糖酵解转变的重要关键酶之一,在糖脂代谢以及ATP形成过程发挥重要作用。已有研究证实,PDK4是肿瘤、肥胖、糖尿病等多种代谢性疾病的重要干预靶点,且与心血管疾病关系密切,参与心肌缺血/再灌注损伤、心肌重塑等病理过程。有研究表明PDK4在动脉粥样硬化人群的钙化血管中高表达,提示PDK4可能参与血管钙化形成。本课题旨在研究PDK4及其相关的信号通路在血管钙化中的作用及分子机制。第一部分PDK4在VSMC表型转化及血管钙化中的作用目的:探寻PDK4在VSMC表型转化及钙化发生中的作用。方法:由动物实验和细胞实验两部分构成。动物实验:将32只雄性SD大鼠随机分为四组,每组8只,分别为:1)对照组（NC组）:生理盐水肌注和花生油灌胃;2)钙化组（VDN组）:维生素D3（3×105 U/kg）肌注和尼古丁（25 mg/kg,溶于5 m L花生油）灌胃;3)DCA+VDN组:维生素D3联合尼古丁诱导钙化基础上给予50 mg/kg的PDK4抑制剂二氯乙酸（dichloroacetate,DCA）灌胃;4)DCA组:DCA剂量为50 mg/kg灌胃。干预8周后处死。H&E染色、Von Kossa染色分别检测主动脉形态学变化和钙化结节。Western blotting检测PDK4蛋白表达及PDHA1（S293）磷酸化水平变化。细胞实验:采用10mmol/Lβ-甘油磷酸（β-GP）诱导VSMC钙化。构建慢病毒表达载体介导shRNA沉默PDK4并转染VSMC,分组如下:空载慢病毒组（Lv-shRNA-NC组）、慢病毒介导shRNA转染细胞组（Lv-shRNA-PDK4组）、Lv-shRNA-NC+β-GP组、Lv-shRNA-PDK4+β-GP组。茜素红染色、邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞内钙含量。Western blotting检测PDK4、RUNX2的蛋白表达。RT-qPCR检测PDK4对成骨相关基因mRNA水平的影响。结果:（1）与NC组相比,VDN组主动脉管壁中层弹力纤维排列较为紊乱,广泛分布黑色颗粒状沉积,伴随PDK4蛋白表达和PDHA1（S293）磷酸化水平升高;与VDN组相比,DCA+VDN组中主动脉壁结构较为完整,少量黑色颗粒状沉积,PDK4蛋白表达与PDHA1（S293）磷酸化水平均下降。（2）与Lv-shRNA-NC+β-GP组相比,Lv-shRNA-PDK4+β-GP组中BMP2、RUNX2等成骨相关基因的m RNA水平下降,橘红色颗粒状钙化结节明显减少。钙定量检测结果表明,使用DCA抑制PDK4活性可减轻β-GP诱导的VSMC钙化。结论:PDK4在血管钙化过程中表达升高,慢病毒介导的PDK4基因沉默或DCA抑制其活性可减轻血管钙化。第二部分PDK4对线粒体结构和葡萄糖代谢的影响目的:探寻PDK4在钙化过程中对VSMC线粒体结构和葡萄糖代谢的作用。方法:PDK4的RNA干扰慢病毒表达载体转染VSMC,实验分组同前。透射电镜观察PDK4对线粒体结构的影响。Western blotting检测PDK4对糖酵解相关基因表达的影响。乳酸试剂盒检测胞内乳酸含量变化。葡萄糖类似物2-NBDG测定VSMC葡萄糖摄取能力。结果:（1）透射电镜结果表明,与对照组相比,钙化组中部分线粒体出现肿胀、线粒体膜结构不清以及线粒体嵴紊乱。然而,通过DCA抑制PDK4可提高线粒体结构的完整性。（2）与对照组相比,钙化组中GLUT1、PKM2、LDHA和MCT4蛋白表达升高,葡萄糖摄取率增加,胞内乳酸含量升高,慢病毒介导的PDK4基因沉默或DCA抑制其活性能够降低糖酵解相关基因的蛋白表达,减轻VSMC葡萄糖摄取和乳酸产生。氧耗量结果表明,钙化过程中VSMC的基础氧耗率和最大氧耗率均有不同程度下降,而在钙化条件下沉默PDK4可改善细胞氧耗率。结论:抑制PDK4可减轻钙化过程中VSMC线粒体结构受损,提高VSMC氧化磷酸化水平。第三部分PDK4调控VSMC自噬在血管钙化中的作用目的:研究PDK4对细胞自噬的影响及其在血管钙化中的作用。方法:PDK4的RNA干扰慢病毒表达载体转染VSMC,实验分组同前。茜素红染色、邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞内钙含量。Western blotting检测LC3、p62、LAMP1、LAMP2和CTSD的蛋白表达变化。GFP-RFP-LC3双标慢病毒检测自噬流变化。Lyso-Tracker Red标记溶酶体并利用共聚焦显微镜观察其活性变化。绿色荧光物质BODIPY FL标记的BSA淬灭试验检测溶酶体降解功能。结果:（1）透射电镜结果表明,较对照组相比,钙化组中存在更多的自噬体。Western blotting结果表明,与对照组相比,β-GP组中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和p62蛋白表达均升高。（2）与对照组相比,β-GP组中溶酶体活性降低,LAMP1、LAMP2、CTSD蛋白表达下降,溶酶体降解能力下降。（3）与Lv-shRNA-NC相比,Lv-shRNA-PDK4的LC3Ⅱ、p62蛋白水平下降,提示沉默PDK4能够增加自噬体降解。共聚焦结果表明,与Lv-shRNA-NC+β-GP组相比,Lv-shRNA-PDK4+β-GP组中RFP-LC3的点状分布增加。（4）与β-GP组相比,使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）或氯喹（chloroquine,CQ）与β-GP共孵育组中VSMC钙含量显著升高;而使用自噬诱导剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA）预处理VSMC可减轻细胞内钙盐沉积。（5）与Lv-shRNA-NC+β-GP组相比,Lv-shRNA-PDK4+β-GP组中RUNX2蛋白表达下降,VSMC钙含量下降;而使用CQ阻断自噬后,两组间RUNX2蛋白表达和VSMC钙含量无明显差异。结论:沉默PDK4可上调钙化过程中VSMC自噬,减轻VSMC钙化。第四部分二甲双胍调控线粒体生物发生在VSMC钙化中的作用目的:观察钙化过程中二甲双胍（Metformin,Met）对VSMC线粒体生物发生的影响,探寻Met调控PDK4在血管钙化中的作用。方法:实验分组为正常组、β-GP组、β-GP+Met组、Met组。茜素红染色、邻甲酚酞络合酮比色法检测Met对细胞内钙含量的影响。Western blotting检测Met对PDK4表达的影响。RT-q PCR检测Met对成骨相关基因和线粒体生物发生相关基因的m RNA水平的影响。透射电镜观察线粒体超微结构变化。JC-1检测线粒体膜电位变化。Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡变化。结果:（1）与对照组相比,β-GP组中RUNX2、BMP2、OCN的m RNA上升,细胞间质中可见较多橘红色矿化结节形成;而Met干预后可减轻β-GP的促钙化效应。（2）β-GP组中PDK4蛋白表达较对照组显著升高,而Met与β-GP共孵育组中PDK4蛋白表达较β-GP组下降。（3）与对照组相比,β-GP组中VSMC超微结构受到破坏,ATP含量、线粒体DNA拷贝数和线粒体膜电位均降低,伴随PGC1-α、NRF1和TFAM的m RNA水平下降;而Met干预后可逆转上述改变。（4）与对照组相比,β-GP组中Bax、Cleaved-caspase 3蛋白表达升高,Bcl-2蛋白下降;而通过药物AZT破坏线粒体生物发生进一步增强凋亡作用。（5）β-GP组中VSMC凋亡率较对照组显著升高,而DCA+β-GP组中VSMC凋亡下降。利用PDK4过表达质粒瞬时转染VSMC,在钙化条件下,与NC-OE组相比,NC-OE+Met组Bax、Cleaved-caspase 3蛋白表达下降,Bcl-2蛋白表达升高;而PDK4过表达可逆转上述效应。结论:Met通过上调线粒体生物发生,可减轻PDK4介导的VSMC凋亡,降低VSMC钙化。