【摘 要】
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马立克氏病是一种高度致瘤性的由鸡甲型疱疹病毒---马立克氏病病毒引起的致命的T细胞淋巴瘤,它也是一种自然病毒诱导的鸡肿瘤模型。现有疫苗可以预防MDV引起的肿瘤,但不能有效地防止MDV的传播或感染,导致越来越强毒力的毒株出现。Meq蛋白与MDV毒力的潜伏期、转化和进化均有关,Meq蛋白的表达是T细胞转化为淋巴瘤细胞的关键。目前,经免疫后的鸡群中既存在弱毒疫苗株也存在持续进化的野毒株,甚至出现了疫苗无
【基金项目】
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国家自然科学基金（31972717）； 江苏高校优势学科建设工程资助项目；
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马立克氏病是一种高度致瘤性的由鸡甲型疱疹病毒---马立克氏病病毒引起的致命的T细胞淋巴瘤,它也是一种自然病毒诱导的鸡肿瘤模型。现有疫苗可以预防MDV引起的肿瘤,但不能有效地防止MDV的传播或感染,导致越来越强毒力的毒株出现。Meq蛋白与MDV毒力的潜伏期、转化和进化均有关,Meq蛋白的表达是T细胞转化为淋巴瘤细胞的关键。目前,经免疫后的鸡群中既存在弱毒疫苗株也存在持续进化的野毒株,甚至出现了疫苗无法保护的超强毒株和特超强毒株,这种形势给MD的防治带来困难。由于禽白血病病毒也能引起感染鸡发生肿瘤,且在组织学上较难区分,因此需要建立一种准确、特异性强的检测方法来检测MDV引起的肿瘤。在本研究中,我们通过杆状病毒表达系统表达RB1B毒株的Meq癌蛋白,进而制备抗Meq癌蛋白的单克隆抗体,初步建立了一种免疫组化检测方法,用于诊断MDV引起的淋巴瘤。1.马立克氏病毒meq基因的克隆与表达本研究根据Genbank已发表的资料,合成特异性引物用PCR的方法扩增鸡马立克氏病病毒RB1B毒株的meq基因,将纯化的PCR产物分别连接至真核表达载体pCAGGS和杆状病毒供体质粒pFastBacHTA中,构建真核重组质粒pCAGGS-Meq及重组供体质粒pFastBacHTA-Meq。将测序正确的真核重组质粒pCAGGS-Meq转染293T细胞,使用IFA和Western blot进行分析,结果显示真核重组载体pCAGGS-Meq可以在293T细胞上获得表达。将测序正确的重组供体pFastBacHTA-Meq质粒转到DH10BacTM感受态细胞,得到重组穿梭质粒rBacmid-MDV-Meq,然后再将重组穿梭质粒转染Sf9细胞后得到重组杆状病毒rBac-MDV-Meq。Sf9细胞感染rBac-MDV-Meq后,用IFA和Western blot进行分析,结果表明,重组杆状病毒表达的Meq蛋白以可溶性、非分泌性的方式在细胞核内表达,分子量大小约为60 kDa。2.马立克氏病病毒Meq蛋白单克隆抗体的制备本研究以上述重组杆状病毒rBac-MDV-Meq表达的Meq蛋白作为免疫原,免疫6～8周龄的BALB/c小鼠。每10天免疫一次,免疫三次后,取效价高的小鼠淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合。将真核重组质粒pCAGGS-Meq转染293T细胞后,利用IFA检测得到4株能够分泌抗Meq的单克隆抗体的杂交瘤细胞,将这些杂交瘤细胞株进行命名:MDV-Meq-1D6、MDV-Meq-1D10、MDV-Meq-6B3 和 MDV-Meq-6D10。应用Western blot进行验证后证明获得的4株单克隆抗体均能与真核表达蛋白发生特异性反应。亚类鉴定表明4株单克隆抗体中,有3株重链均为IgG1,有1株为IgG2a,轻链均为Kappa链。用4株杂交瘤细胞制备腹水,并对其进行IFA效价测定,荧光结果显示4株单抗腹水效价均在1:3200左右。3.基于Meq蛋白马立克氏病免疫组化方法的建立本研究以上述马立克氏病病毒Meq单克隆抗体为一抗,通过对免疫组化操作步骤中的修复抗原、单抗稀释度、DAB显色和苏木素复染时间等多个步骤进行优化,建立了以特异性的Meq单克隆抗体为一抗的免疫组化检测MD的方法,这种检测方法能检测到人工感染MDV鸡心脏、肝脏肿瘤组织中的Meq蛋白,染色后显示抗原主要定位在细胞核,为今后MDV的诊断与防治提供了参考。
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