【摘 要】
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种急性、烈性、传染性猪病。猪感染后发病迅速,病死率较高。ASFV自1921年在肯尼亚发现以来,至今已流行一百余年,ASF已传至非洲、美洲及欧亚大陆等地区,对养猪行业和食品安全带来巨大威胁。然而,ASFV有效的商品化疫苗至今尚未研制成功。病毒活载体疫苗可诱
【基金项目】
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国家重点研发计划课题（表达非洲猪瘟病毒保护性抗原病毒活载体疫苗和亚单位疫苗的研制/编号:2017YFD502303）；
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种急性、烈性、传染性猪病。猪感染后发病迅速,病死率较高。ASFV自1921年在肯尼亚发现以来,至今已流行一百余年,ASF已传至非洲、美洲及欧亚大陆等地区,对养猪行业和食品安全带来巨大威胁。然而,ASFV有效的商品化疫苗至今尚未研制成功。病毒活载体疫苗可诱导猪产生较好免疫保护,成为当前研究热点。本研究以复制缺陷型人类5型腺病毒为载体,构建携带多个ASFV保护性抗原基因的重组腺病毒载体,通过小鼠模型进行免疫试验分析,旨在为后期免疫猪试验提供理论依据,为ASFV病毒活载体疫苗研究提供基础。本研究将从 pUC57-A151R-B438L-K205R-A104R、pUC57-EP402R-CP204L-E183L、pUC57-D117L-F317L-EP364R、pUC57-EP153R-B646L 4 个载体中扩增出的目的片段克隆到腺病毒载体上构建出 pAd-EGFP-P2A-A151R-B438L-K205R-A104R、pAd-EGFP-P2A-EP402R-CP204L-E 183L、pAd-EGFP-P2A-D1 17L-F317L-EP364R、pAd-EGFP-P2A-EP153R-B646L 4个ASFV重组腺病毒载体。将4个ASFV重组腺病毒载体用内切酶PacI酶切线性化后分别转染293A细胞包装获得4株重组腺病毒。结果表明:4株重组腺病毒中rAd-A151R-B438L-K205R-A104R滴度最高,4株重组腺病毒感染细胞后都可检测到融合目的蛋白表达。为检测重组腺病毒的免疫效果,我们用4株重组腺病毒免疫小鼠进行效果评价。同时构建ASFV保护性抗原原核表达载体,纯化ASFV相应蛋白用于小鼠免疫试验中的检测。首免后2 W和4 W各进行一次加强免疫,免疫后第14 d除rAd-EP402R-CP204L-E1 83L免疫组小鼠血清中特异性抗体较对照组无明显升高,其余3个重组腺病毒免疫组特异性抗体水平高于对照组,与对照组相比差异极显著（P<0.01）。加强免疫后4个重组腺病毒免疫组特异性抗体水平显著升高,与对照组相比差异均极显著（P<0.01）。免疫后42 d分离小鼠的脾脏淋巴细胞,用原核表达的ASFV重组蛋白体外刺激分离的淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖结果显示rAd-D117L-F317L-EP364R和rAd-EP153R-B646L免疫组增殖水平高于对照组,其余两组无明显增殖。用IL-4和IFN-γ ELISA检测试剂盒检测淋巴细胞刺激后上清中IL-4和IFN-γ的水平,其结果与淋巴细胞增殖结果基本相符。本研究通过将ASFV 12个保护性抗原基因克隆到腺病毒载体上,成功构建出4株重组腺病毒,并可表达ASFV的抗原蛋白。4株重组腺病毒分别免疫小鼠后均可诱导产生较好的体液免疫应答,尤以rAd-D117L-F317L-EP364R诱导的特异性抗体水平最高。淋巴细胞增殖试验和细胞因子水平检测结果显示rAd-D117L-F317L-EP364R免疫组和rAd-EP153R-B646L免疫组可诱导产生较好的细胞免疫应答。
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