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鸡球虫病是一种由艾美耳属球虫引起的呈世界性分布的寄生虫病,给养鸡业造成巨大的经济损失。鸡球虫种类多,临床多呈混合感染,其中致病性最强的是柔嫩艾美耳球虫。本研究通过对琼脂分离单球虫卵囊方法进行改进,建立了球虫单卵囊胶囊分离技术,应用该技术成功地分离出一株球虫,即柔嫩艾美耳球虫合肥(HF)株,并对其致病性进行了研究。首先,从合肥市肥西县选择具有球虫病典型症状的病鸡,取其盲肠内容物,用沉浮法收集柔嫩艾美耳球虫的野外混合株,加入适量的2.5%重铬酸钾溶液,置于27℃恒温箱中培养。查阅有关资料,对球虫单卵囊分离方法进行了改进,建立了一种新的球虫单卵囊分离方法,即球虫单卵囊胶囊分离技术:用2%琼脂块分离到一个球虫卵囊后,用胶囊封好,制成单卵囊胶囊。将胶囊经口接种8只5日龄无球虫雏鸡,进行单卵囊胶囊人工感染试验。从第4天起,每天收集粪便,检查卵囊排出情况,第12天剖杀全部雏鸡。结果,8只鸡中有3只感染成功,感染成功率为37.5%。其次,对所分离到的虫株进行形态学鉴定。将上述单卵囊后代经12日龄无球虫雏鸡增殖两代,对连续两代卵囊进行形态观察,测得第一代(150个)卵囊的大小为16.8～24.6μm×16.1～20.7μm,平均大小为21.24μm×18.14μm。卵形指数为1.17。孢子囊大小为10.10～12.95μm×4.40～7.25μm,平均大小为11.60μm×5.99μm。第二代(150个)卵囊的大小为17.6～23.3μm×15.5～20.5μm,平均大小为21.11μm×18.04μm,卵形指数为1.17。孢子囊大小为10.10～12.95μm×4.60～7.25μm,平均大小为11.59μm×6.01μm。对两次测量数据进行差异显著性检验(F检验),其结果差异不显著,而且第二代球虫的寄生部位和病理变化与第一代相同,结果都符合柔嫩艾美耳球虫的特征,因此初步鉴定本试验分离的球虫为柔嫩艾美耳球虫,暂命名为柔嫩艾美耳球虫合肥(HF)株。再次,采用饱和食盐溶液浓缩卵囊,高速组织匀浆机破碎卵囊,用基因组抽提试剂盒提取卵囊基因组。参照Schnitzler, B.E.等设计的引物:5’-AAT TTA GTC CAT CGC AAC CCT-3’;5’-CGA GCG CTC TGC ATA CGA CA- 3’进行PCR反应,成功扩增出278bp的特异性片断。对扩增片断进行克隆测序,并在网上进行blast分析,表明所扩增的基因序列与已报道的柔嫩艾美耳球虫标准株基因序列有高度同源性。最后,将柔嫩艾美耳球虫HF株感染雏鸡,并从临床症状、病变积分、病理变化等方面进行致病性分析。结果显示:当接种1.0×10~4个卵囊时就引起雏鸡死亡,致死率为10%;接种2.0×10~4个卵囊时,致死率为20%;接种4.0×10~4个卵囊时致死率为30%;接种8.0×10~4个卵囊时致死率为70%;接种1.6×10~5个卵囊时致死率达90%。表明随着卵囊接种量的增多,雏鸡死亡率也随之增高。说明柔嫩艾美耳球虫HF株的致病力很强。综上所述,本研究成功地建立了一种新的球虫单卵囊分离技术,应用此技术分离到一株柔嫩艾美耳球虫,对该株球虫进行了形态学和分子生物学鉴定,并对其致病性进行了分析。球虫单卵囊胶囊分离技术的建立为纯种球虫的获得提供了一种新方法;柔嫩艾美耳球虫HF株的分离鉴定及其致病性研究对合肥地区鸡球虫病的防治,提高养鸡业经济效益具有一定意义。