【摘 要】
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鸭坦布苏病毒病是危害禽类的主要传染病之一,由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）感染引起,临床症状表现为产蛋鸭的产蛋下降、卵巢出血,雏鸭高热、生长迟缓和瘫痪。而DTMUV E蛋白是其主要的毒力抗原,与病毒的致病性密切相关,具有良好的免疫原性,同时E蛋白Domain Ⅲ结构域是病毒受体的主要结合区域,富集大量的抗原表位。因此,本试验以DTMUV E Domain Ⅲ重组蛋
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鸭坦布苏病毒病是危害禽类的主要传染病之一,由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）感染引起,临床症状表现为产蛋鸭的产蛋下降、卵巢出血,雏鸭高热、生长迟缓和瘫痪。而DTMUV E蛋白是其主要的毒力抗原,与病毒的致病性密切相关,具有良好的免疫原性,同时E蛋白Domain Ⅲ结构域是病毒受体的主要结合区域,富集大量的抗原表位。因此,本试验以DTMUV E Domain Ⅲ重组蛋白为免疫原制备抗DTMUV单克隆抗体并初步应用,为DTMUV相关研究提供有效抗体工具。首先,采用RT-PCR方法从AQ-19株DTMUV细胞毒中扩增E Domain Ⅲ基因,并将其构建至p Cold-SUMO载体,构建成功后大量诱导表达并纯化E Domain Ⅲ重组蛋白,将其作为后续ELISA筛选单克隆抗体的筛选抗原。同时,对重组质粒p ET-32a-E Domain Ⅲ诱导表达E Domain Ⅲ重组蛋白并纯化,以其作为单克隆抗体抗制备的免疫原。结果显示,成功构建p Cold-SUMO-E Domain Ⅲ表达载体,并诱导两种不同重组质粒表达了E Domain Ⅲ蛋白。其次,以p ET32a-E Domain Ⅲ表达纯化后的蛋白作为免疫原,按免疫程序对BALB/c小鼠进行免疫,免疫后对其进行效价检测,利用化学融合剂PEG 1 000融合免疫小鼠的脾细胞和sp2/0骨髓瘤细胞,采用有限稀释法对融合后的杂交瘤细胞进行筛选,对筛选成功的阳性杂交瘤细胞采用IFA、Western Blot和ELISA进行鉴定,并制备单克隆抗体腹水。随后对制备的腹水进行中和试验和单克隆抗体分型检测。结果显示成功制备3株特异性强、敏感性高的抗DTMUV E Domain Ⅲ蛋白的鼠源单克隆抗体,并将其命名为B9D10C7、B9D7B8G10、B9D7B8F11,其亚型分别为Ig G1、Ig G2b、Ig G3。IFA和WB结果显示3株单克隆抗体均能够特异性的识别天然DTMUV E蛋白,同时病毒中和试验表明B9D10C7株单克隆抗体具有中和病毒的活性。此外,我们还利用制备的B9D10C7株单克隆抗体作为检测DTMUV的抗体工具,对石蒜碱抑制DTMUV在BHK-21细胞上增殖的机制进行了初步探究。初步的研究结果表明,石蒜碱在BHK-21细胞上对DTMUV具有剂量依赖性抑制作用。综上所述,本研究成功表达了可溶性的DTMUV E Domain Ⅲ蛋白,并以其为免疫原制备抗DTMUV单克隆抗体,经过鉴定制备的单克隆抗体特异性强、敏感性高,可以特异性识别天然的DTMUV E蛋白,为DTMUV快速诊断试剂试纸条的研制、致病机制研究提供了有效的抗体工具。同时,在石蒜碱体外抑制DTMUV病毒的研究中,发现石蒜碱对DTMUV具有剂量依赖性抑制作用。
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