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在鸡群各类流行病中鸡球虫病占据很高的致病率，据统计其致死率高达30％，对养殖业造成极大的经济损失。但迄今，鲜有与艾美耳球虫入侵相关的宿主细胞相关蛋白的报道。为了全面研究宿主细胞参与球虫入侵、发育和增殖等相关的功能蛋白，我们利用iTRAQ联合质谱分析了宿主BHK-21细胞在柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵24h后的差异表达蛋白，对其中3个差异蛋白，即活化蛋白激酶C受体1(Receptor for activated C kinase1，RACK1)、转移基因3(Metastasis associated gene3，MTA3)、核纤层蛋白B受体(Lamin B receptor，LBR)在子孢子入侵中的功能进行了初步研究，研究结果为深入探讨球虫与宿主之间的互作关系奠定基础。 1.基于iTRAQ技术分析柔嫩艾美耳球虫感染BHK-21细胞的蛋白质组学 柔嫩艾美耳球虫是专性胞内寄生虫，主要侵入鸡的盲肠上皮细胞。在艾美耳球虫感染宿主细胞过程中，不仅是寄生虫起着关键作用，而且宿主也会产生相应的变化来应对感染引起的损伤。本研究利用iTRAQ偶联LC-MS/MS技术，筛选感染柔嫩艾美耳球虫子孢子24h后BHK-21细胞的差异表达蛋白（Differentially expressed proteins，DEPs）。结果共鉴定到6139个非冗余蛋白，获得195个（倍数变化比≥1.3或≤0.7和P＜0.05）DEPs，其中上调蛋白151个、下调蛋白44个。选取12个上调蛋白和2个下调蛋白分别进行qRT-PCR和Western blot，其结果与iTRAQ的结果一致，表明iTRAQ的数据可靠。GO富集分析表明，上调DEPs主要涉及结合和催化活性，而下调DEPs主要涉及催化活性和分子功能调节。KEGG通路显示，DEPs主要参与PI3K-Akt信号通路、RIG-I受体介导的吞噬通路、Ras信号通路和p53信号通路等，其中上调和下调的DEPs分别主要与核糖体和mRNA的监控通路有关。研究结果为深入研究球虫与宿主之间的互作关系提供了重要的基础数据。 2.柔嫩艾美耳球虫子孢子感染对宿主RACK1的影响 以鸡肌肉的cDNA为模板，利用PCR技术对RACK1进行克隆，将克隆片段与pGEX-6P-1连接，构建原核表达质粒pGEX-6P-1-RACK1，在BHK-21细胞中进行表达，获得重组蛋白RACK1-GST。将纯化的重组蛋白进行电泳验证，结果在61kDa处有单一的目的条带，证实所获得的蛋白为RACK1-GST融合蛋白。利用RT-qPCR和Western blot检测子孢子感染DF-1细胞过程中RACK1的mRNA转录水平和蛋白表达水平，结果显示，子孢子感染细胞24-72h时，细胞RACK1的转录水平和蛋白表达水平均明显提高。利用抗体抑制试验观测RACK1多抗对虫体入侵细胞的影响，结果表明，100μg/mL和200μg/mL RACK1抗体孵育细胞后对虫体的入侵影响不大，而300μg/mL和400μg/mL孵育细胞后能明显促进虫体的入侵。以上结果表明，宿主RACK1对球虫子孢子入侵细胞起负调控的作用，但具体机制尚需深入研究。 3.柔嫩艾美耳球虫子孢子感染对宿主MTA3和LBR的影响 为了探索球虫入侵宿主细胞中MTA3和LBR发挥的作用，我们检测了感染球虫子孢子24-72h时的细胞中两者转录水平和翻译水平的变化以及其抗体对子孢子入侵细胞的影响。结果显示，随入侵时间的增加，MTA3转录水平和翻译水平表达量不断增加，24h组明显高于不感染组(P＜0.05)，而48h组和72h组的MTA3翻译水平均明显高于24h组和不感染组(P＜0.05)。但LBR转录水平和翻译水平表达量随着入侵时间的增加而不断减少，24h组低于不感染组，但差异不显著(P＞0.05)，而48h组和72h组的LBR翻译水平均低于24h组和不感染组(P＜0.05)。以浓度为10μg/mL和20μg/mL MTA3或LBR抗体作用细胞后对子孢子的入侵影响不大，入侵率与对照组和正常IgG组的相当(P＞0.05)。抑制效果不理想可能与所用抗体浓度不高（10-20μg/mL）相关，后续需要用更大浓度的抗体来进行子孢子入侵抑制试验，以确定MTA3和LBR是否是与球虫入侵相关的蛋白。 4.柔嫩艾美耳球虫子孢子感染对细胞凋亡的影响 通过对筛选到的差异基因进行KEGG富集分析，我们预测得到一些差异基因参与凋亡相关的通路，如MAPK、Wnt、Ras等通路。为了进一步探究柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵对细胞凋亡的影响，我们对凋亡通路中的凋亡酶进行了测定。与对照组相比，感染子孢子12h和24h组的Caspase-3和Caspase-9的酶活性均差异显著(P＜0.05)，且随感染时间的增加，凋亡酶的活性显著升高。结果表明子孢子的入侵会加速宿主细胞的凋亡，但其具体机制有待进一步的研究。