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目的：
甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的甲状腺肿瘤类型，约占所有甲状腺癌病例的80％。目前，PTC的主要疗法包括手术、化疗和放疗，大多数PTC患者经系统治疗后反应良好，然而，PTC复发率较高，且有些患者会发生预后不良。因此，揭示PTC发生和发展的潜在分子机制对于有效治疗方案的制定以及提高PTC患者的治愈率至关重要。
MicroRNAs（miRNAs）是一类小的非编码RNA，可以结合特定基因的3-非翻译区（3-UTR）以抑制相应靶mRNA的翻译。研究表明miRNAs的异常表达与人类恶性肿瘤的发生和发展密切相关。miRNAs作为癌基因或抑癌基因，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭。多项研究证实，miR-200b/c在多种肿瘤中表达异常，包括胃癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胆管癌等。然而，关于miR-200b/c在PTC中的具体作用及机制尚不明确。
RAP1是一种小的Ras样GTP酶，它可以调节多种细胞过程，包括细胞粘附、迁移、极性、分化、生长和血管生成。Ras相关蛋白1B（Ras-related protein1B，RAP1B）是RAP1的一种亚型，研究表明，在多种类型的人类癌症中RAP1B存在异常表达，RAP1B过表达可促进癌细胞增殖、侵袭和转移。然而，RAP1B在PTC中的功能还不知晓。
前期通过生物信息学软件预测发现，RAP1B是miR-200b/c的靶基因。因此，本论文主要研究miR-200b/c靶向RAP1B在PTC中的作用及机制，首先在临床水平利用HE分析了PTC组织和癌旁组织的形态学差异，另外qRT-PCR、Western blot和免疫组化检测了miR-200b/c和RAP1B在PTC组织及细胞中的表达，并对miR-200b/c和RAP1B的表达进行了相关性分析；其次在细胞水平，首先利用在线生物信息学软件对miR-200b/c的靶基因进行了预测，并利用双荧光素酶报告基因实验进一步验证了miR-200b/c与RAP1B的靶向关系，另外构建了miR-200b过表达、miR-200c过表达和RAP1B过表达三种载体，并建立了miR-200b/c过表达以及miR-200b/c和RAP1B同时过表达的稳定细胞系，利用MTT、克隆形成、Transwell小室实验、划痕实验、流式细胞术以及Western blot检测了miR-200b/c靶向RAP1B对PTC细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移、凋亡以及NF-κB/Twist1信号通路的影响；最后拟体内研究，利用TPC-1细胞移植构建了PTC荷瘤小鼠模型，进一步探讨了miR-200b/c靶向RAP1B对PTC移植瘤生长的影响及机制。
本论文旨在探讨miR-200b/c靶向RAP1B在PTC中的作用以及对其机制的研究，为靶向治疗PTC提供新的生物标记物及治疗靶点。
本论文主要分为三个部分：
第一部分：miR-200b/c和RAP1B在PTC中的表达研究；
第二部分：miR-200b/c靶向RAP1B对PTC细胞生物学特性的影响及机制研究；
第三部分：miR-200b/c靶向RAP1B对裸鼠皮下PTC移植瘤生长的影响及机制研究。
主要内容：
第一部分：miR-200b/c和RAP1B在PTC中的表达研究
方法:
1.HE染色检测PTC组织和癌旁组织的形态学差异。
2.qRT-PCR检测miR-200b/c及RAP1B mRNA在PTC组织和细胞中的表达情况。
3.免疫组化检测RAP1B蛋白在PTC组织中的表达。
4.Western Blot检测PTC组织及细胞系TPC-1、BCPAP、NPA87、K1中相关蛋白RAP1B的表达水平。
5.利用Graphpad Prism7软件对miR-200b/c和RAP1B的表达水平进行相关性分析。
结果：1.HE染色结果发现，癌旁正常组织细胞形态正常，无异型细胞，而PTC组织中可见分支状的排列无序的乳头。
2.与癌旁正常组织相比，miR-200b/c在PTC组织中的表达明显降低，而RAP1B mRNA及RAP1B蛋白的表达水平名明显升高。
3.与正常甲状腺上皮细胞Nthy-ori3-1相比，miR-200b/c在PTC细胞中呈现低表达，而RAP1B mRNA及RAP1B蛋白呈现高表达。其中在TPC-1、K1细胞中miR-200b/c的表达下调最明显，RAP1B mRNA和蛋白的表达上调最明显。因此选择TPC-1、K1细胞进行后续的功能研究。
4.在PTC组织中miR-200b/c和RAP1B的表达水平呈负相关。
第二部分：miR-200b/c靶向RAP1B对PTC细胞生物学特性的影响及机制研究
方法:
1.生物信息学软件预测miR-200b、miR-200c与RAP1B的结合位点。
2.构建miR-200b过表达、miR-200c过表达和RAP1B过表达三种载体，重组慢病毒载体经包装和滴定后，感染TPC-1细胞和K1细胞，构建miR-200b过表达、miR-200c过表达以及miR-200b/c+RAP1B共表达三种稳定细胞系。
3.双荧光素酶报告基因实验验证miR-200b/c和RAP1B的靶向关系。
4.MTT检测miR-200b/c-RAP1B axis对TPC-1、K1细胞增殖的影响。
5.细胞克隆形成实验验检测miR-200b/c-RAP1B axis对TPC-1、K1细胞克隆形成的影响。
6.划痕实验检测miR-200b/c-RAP1B axis对TPC-1、K1细胞迁移的影响。
7.Transwell实验检测miR-200b/c-RAP1B axis对TPC-1、K1细胞侵袭的影响。
8.流式细胞术检测miR-200b/c-RAP1B axis对TPC-1、K1细胞凋亡的影响。
9.Western blot检测miR-200b/c-RAP1B axis对TPC-1、K1细胞EMT及NF-κB/Twist1信号通路的影响。
10.ELISA检测miR-200b/c-RAP1B axis对NF-κB活性的影响。
结果：1.双荧光素酶报告基因实验验证RAP1B是miR-200b/c的靶基因。
2.miR-200b/c过表达明显抑制PTC细胞TPC-1和K1中RAP1B的表达。
3.在PTC细胞TPC-1和K1中，miR-200b/c过表达可靶向抑制RAP1B的表达，进而抑制NF-κB/Twist1信号通路的活性，从而抑制细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭以及EMT的发生，并促进细胞凋亡。
第三部分：miR-200b/c靶向RAP1B对PTC裸鼠皮下移植瘤生长的影响及机制研究
方法:
1.在BABL/nude雌性裸鼠腋下接种vector、miR-200b、miR-200c组TPC-1细胞，构建了PTC荷瘤小鼠模型，并检测移植瘤的体积和重量。
2.Western blot检测各组PTC移植瘤中RAP1B、EMT进程中相关蛋白、NF-κB/Twist1信号通路相关蛋白NF-κB p65、Twist1的表达情况。
3.HE检测各组PTC移植瘤中的组织形态。
4.ELISA检测miR-200b/c对PTC移植瘤内NF-κB活性的影响。
结果：
1.成功构建vector、miR-200b、miR-200c3组PTC荷瘤小鼠模型。
2.对移植瘤的体积和质量检测发现，miR-200b与miR-200c过表达可以明显抑制PTC移植瘤的生长。
3.HE染色结果发现，与vector组相比，miR-200b/c过表达组PTC移植瘤细胞皱缩，形态呈不规则状态，组织恶性程度明显降低。
4.Western blot检测发现，miR-200b/c过表达可抑制PTC移植瘤中RAP1B以及EMT相关蛋白的表达。
5.miR-200b与miR-200c过表达可抑制PTC移植瘤中NF-κB/Twist1通路的活性。
结论:
1.与癌旁正常组织及Nthy-ori3-1细胞相比，PTC组织及细胞中miR-200b/c的表达水平显著降低，而RAP1B的表达水平显著升高。在PTC组织中miR-200b/c和RAP1B的表达水平呈负相关。
2.体内外实验均表明，miR-200b/c过表达能够通过靶向RAP1B抑制NF-κB/Twist1信号通路的活性，从而抑制其细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、EMT过程，并促进细胞凋亡，最终抑制PTC的发展。
甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的甲状腺肿瘤类型，约占所有甲状腺癌病例的80％。目前，PTC的主要疗法包括手术、化疗和放疗，大多数PTC患者经系统治疗后反应良好，然而，PTC复发率较高，且有些患者会发生预后不良。因此，揭示PTC发生和发展的潜在分子机制对于有效治疗方案的制定以及提高PTC患者的治愈率至关重要。
MicroRNAs（miRNAs）是一类小的非编码RNA，可以结合特定基因的3-非翻译区（3-UTR）以抑制相应靶mRNA的翻译。研究表明miRNAs的异常表达与人类恶性肿瘤的发生和发展密切相关。miRNAs作为癌基因或抑癌基因，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭。多项研究证实，miR-200b/c在多种肿瘤中表达异常，包括胃癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胆管癌等。然而，关于miR-200b/c在PTC中的具体作用及机制尚不明确。
RAP1是一种小的Ras样GTP酶，它可以调节多种细胞过程，包括细胞粘附、迁移、极性、分化、生长和血管生成。Ras相关蛋白1B（Ras-related protein1B，RAP1B）是RAP1的一种亚型，研究表明，在多种类型的人类癌症中RAP1B存在异常表达，RAP1B过表达可促进癌细胞增殖、侵袭和转移。然而，RAP1B在PTC中的功能还不知晓。
前期通过生物信息学软件预测发现，RAP1B是miR-200b/c的靶基因。因此，本论文主要研究miR-200b/c靶向RAP1B在PTC中的作用及机制，首先在临床水平利用HE分析了PTC组织和癌旁组织的形态学差异，另外qRT-PCR、Western blot和免疫组化检测了miR-200b/c和RAP1B在PTC组织及细胞中的表达，并对miR-200b/c和RAP1B的表达进行了相关性分析；其次在细胞水平，首先利用在线生物信息学软件对miR-200b/c的靶基因进行了预测，并利用双荧光素酶报告基因实验进一步验证了miR-200b/c与RAP1B的靶向关系，另外构建了miR-200b过表达、miR-200c过表达和RAP1B过表达三种载体，并建立了miR-200b/c过表达以及miR-200b/c和RAP1B同时过表达的稳定细胞系，利用MTT、克隆形成、Transwell小室实验、划痕实验、流式细胞术以及Western blot检测了miR-200b/c靶向RAP1B对PTC细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移、凋亡以及NF-κB/Twist1信号通路的影响；最后拟体内研究，利用TPC-1细胞移植构建了PTC荷瘤小鼠模型，进一步探讨了miR-200b/c靶向RAP1B对PTC移植瘤生长的影响及机制。
本论文旨在探讨miR-200b/c靶向RAP1B在PTC中的作用以及对其机制的研究，为靶向治疗PTC提供新的生物标记物及治疗靶点。
本论文主要分为三个部分：
第一部分：miR-200b/c和RAP1B在PTC中的表达研究；
第二部分：miR-200b/c靶向RAP1B对PTC细胞生物学特性的影响及机制研究；
第三部分：miR-200b/c靶向RAP1B对裸鼠皮下PTC移植瘤生长的影响及机制研究。
主要内容：
第一部分：miR-200b/c和RAP1B在PTC中的表达研究
方法:
1.HE染色检测PTC组织和癌旁组织的形态学差异。
2.qRT-PCR检测miR-200b/c及RAP1B mRNA在PTC组织和细胞中的表达情况。
3.免疫组化检测RAP1B蛋白在PTC组织中的表达。
4.Western Blot检测PTC组织及细胞系TPC-1、BCPAP、NPA87、K1中相关蛋白RAP1B的表达水平。
5.利用Graphpad Prism7软件对miR-200b/c和RAP1B的表达水平进行相关性分析。
结果：1.HE染色结果发现，癌旁正常组织细胞形态正常，无异型细胞，而PTC组织中可见分支状的排列无序的乳头。
2.与癌旁正常组织相比，miR-200b/c在PTC组织中的表达明显降低，而RAP1B mRNA及RAP1B蛋白的表达水平名明显升高。
3.与正常甲状腺上皮细胞Nthy-ori3-1相比，miR-200b/c在PTC细胞中呈现低表达，而RAP1B mRNA及RAP1B蛋白呈现高表达。其中在TPC-1、K1细胞中miR-200b/c的表达下调最明显，RAP1B mRNA和蛋白的表达上调最明显。因此选择TPC-1、K1细胞进行后续的功能研究。
4.在PTC组织中miR-200b/c和RAP1B的表达水平呈负相关。
第二部分：miR-200b/c靶向RAP1B对PTC细胞生物学特性的影响及机制研究
方法:
1.生物信息学软件预测miR-200b、miR-200c与RAP1B的结合位点。
2.构建miR-200b过表达、miR-200c过表达和RAP1B过表达三种载体，重组慢病毒载体经包装和滴定后，感染TPC-1细胞和K1细胞，构建miR-200b过表达、miR-200c过表达以及miR-200b/c+RAP1B共表达三种稳定细胞系。
3.双荧光素酶报告基因实验验证miR-200b/c和RAP1B的靶向关系。
4.MTT检测miR-200b/c-RAP1B axis对TPC-1、K1细胞增殖的影响。
5.细胞克隆形成实验验检测miR-200b/c-RAP1B axis对TPC-1、K1细胞克隆形成的影响。
6.划痕实验检测miR-200b/c-RAP1B axis对TPC-1、K1细胞迁移的影响。
7.Transwell实验检测miR-200b/c-RAP1B axis对TPC-1、K1细胞侵袭的影响。
8.流式细胞术检测miR-200b/c-RAP1B axis对TPC-1、K1细胞凋亡的影响。
9.Western blot检测miR-200b/c-RAP1B axis对TPC-1、K1细胞EMT及NF-κB/Twist1信号通路的影响。
10.ELISA检测miR-200b/c-RAP1B axis对NF-κB活性的影响。
结果：1.双荧光素酶报告基因实验验证RAP1B是miR-200b/c的靶基因。
2.miR-200b/c过表达明显抑制PTC细胞TPC-1和K1中RAP1B的表达。
3.在PTC细胞TPC-1和K1中，miR-200b/c过表达可靶向抑制RAP1B的表达，进而抑制NF-κB/Twist1信号通路的活性，从而抑制细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭以及EMT的发生，并促进细胞凋亡。
第三部分：miR-200b/c靶向RAP1B对PTC裸鼠皮下移植瘤生长的影响及机制研究
方法:
1.在BABL/nude雌性裸鼠腋下接种vector、miR-200b、miR-200c组TPC-1细胞，构建了PTC荷瘤小鼠模型，并检测移植瘤的体积和重量。
2.Western blot检测各组PTC移植瘤中RAP1B、EMT进程中相关蛋白、NF-κB/Twist1信号通路相关蛋白NF-κB p65、Twist1的表达情况。
3.HE检测各组PTC移植瘤中的组织形态。
4.ELISA检测miR-200b/c对PTC移植瘤内NF-κB活性的影响。
结果：
1.成功构建vector、miR-200b、miR-200c3组PTC荷瘤小鼠模型。
2.对移植瘤的体积和质量检测发现，miR-200b与miR-200c过表达可以明显抑制PTC移植瘤的生长。
3.HE染色结果发现，与vector组相比，miR-200b/c过表达组PTC移植瘤细胞皱缩，形态呈不规则状态，组织恶性程度明显降低。
4.Western blot检测发现，miR-200b/c过表达可抑制PTC移植瘤中RAP1B以及EMT相关蛋白的表达。
5.miR-200b与miR-200c过表达可抑制PTC移植瘤中NF-κB/Twist1通路的活性。
结论:
1.与癌旁正常组织及Nthy-ori3-1细胞相比，PTC组织及细胞中miR-200b/c的表达水平显著降低，而RAP1B的表达水平显著升高。在PTC组织中miR-200b/c和RAP1B的表达水平呈负相关。
2.体内外实验均表明，miR-200b/c过表达能够通过靶向RAP1B抑制NF-κB/Twist1信号通路的活性，从而抑制其细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭、EMT过程，并促进细胞凋亡，最终抑制PTC的发展。