【摘 要】
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目的:探讨减毒沙门氏菌运载siRNA-PD-L1联合仑伐替尼的抗肝癌作用及作用机制研究。方法:1 临床标本检测收集5例临床肝癌及癌旁正常组织标本,通过免疫荧光的方式检测组织PD-L1、VEGF表达情况。2 体外实验（1）将构建的siRNA-PD-L1序列转染B16细胞,通过WB（Western Blot）检测干扰序列抑制细胞PD-L1表达的能力。（2）将肝癌HepG2细胞铺制不同细胞板,设定PBS
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目的:探讨减毒沙门氏菌运载siRNA-PD-L1联合仑伐替尼的抗肝癌作用及作用机制研究。方法:1 临床标本检测收集5例临床肝癌及癌旁正常组织标本,通过免疫荧光的方式检测组织PD-L1、VEGF表达情况。2 体外实验（1）将构建的siRNA-PD-L1序列转染B16细胞,通过WB（Western Blot）检测干扰序列抑制细胞PD-L1表达的能力。（2）将肝癌HepG2细胞铺制不同细胞板,设定PBS对照组,其余孔加入不同浓度仑伐替尼药物,使用CCK-8实验检测细胞活力,细胞克隆、划痕实验检测药物对细胞增殖、迁移能力的影响;Western blot检测药物对肝癌细胞PD-L1、VEGF、MMP2表达的影响。3 体内实验将周龄为6周左右的雌性C57BL/6小鼠随机分为5组,PBS组、Scramble组、siRNA-PD-L1 组、Lenvatinib 组、siRNA-PD-L1+Lenvatinib 组。通过皮下注射的方式在右大腿外侧建造荷瘤小鼠模型,饲养7天后进行治疗。PBS组给予3mmol/L 稀 HCL 连续灌胃 7 天,0.2ml/只;Lenvatinib 组及siRNA-PD-L1+Lenvatinib组给予仑伐替尼稀HCL溶液连续灌胃7天,0.2ml/只。Scramble组于第7天、第14天给予携空载质粒减毒沙门菌瘤内注射治疗,siRNA-PD-L1 组及 siRNA-PD-L1+Lenvatinib 组于第 7 天及、第 14 天给予携siRNA-PD-L1质粒减毒沙门菌瘤内注射治疗。第21天处死小鼠,完整取脾取瘤,记录肿瘤大小、重量。流式细胞术检测脾脏中淋巴细胞比例。Western blot检测肿瘤组织中PD-L1、VEGF、cleaved Caspase-3、Stat3等相关蛋白表达。HE染色观察组织形态学变化。TUNEL凋亡检测肿瘤组织中凋亡水平。免疫荧光检测肿瘤组织中ki67、PD-L1、VEGF、CD4+、CD8+T细胞以及颗粒酶B表达情况。结果:1.通过临床标本荧光检测发现,肿瘤组织相比瘤旁正常肝组织PD-L1表达升高,VEGF表达升高。2.体外实验表明:（1）在构建的4个siRNA-PD-L1序列中,3、4序列均可以有效抑制PD-L1的表达,且序列4抑制作用最强。（2）仑伐替尼能够抑制肝癌细胞增殖与迁移,并且作用效果随药物浓度升高而增强。Western blot结果表明仑伐替尼能抑制肝癌细胞PD-L1、VEGF的表达,并且作用效果随药物浓度升高而增强。3.体内实验表明:减毒沙门氏菌运载siRNA-PD-L1联合仑伐替尼具有抑制小鼠肝癌生长的效果,且联合治疗的治疗效果大于单一治疗。通过Western blot、免疫荧光检测PD-L1及VEGF结果显示,siRNA-PD-L1抑制了小鼠肿瘤组织中PD-L1的表达,仑伐替尼不仅抑制了肿瘤组织中VEGF的表达,还能同时抑制PD-L1的表达。TUNEL凋亡检测表明,siRNA-PD-L1、仑伐替尼均能促进肿瘤的凋亡,且联合治疗促进凋亡的能力最显著。流式细胞术、免疫荧光检测CD4+、CD8+T细胞结果显示,两种治疗方式均能提高小鼠脾脏中CD4+、CD8+T细胞、NK1.1细胞的比例,同时也能增加肿瘤内CD4+、CD8+T淋巴细胞的浸润。结论:仑伐替尼具有抑制肝癌细胞增殖的能力,并可降低肝癌细胞VEGF的表达。减毒沙门氏菌运载siRNA-PD-L1具有抗肿瘤作用,与仑伐替尼联合治疗能够增强小鼠机体的抗肿瘤免疫反应,显著抑制肿瘤生长。实验结果可为相关技术应用于临床提供一定理论依据。
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