目的： 骨髓移植(bone marrow transplantation，BMT)是治疗白血病、恶性肿瘤、再生障碍性贫血以及免疫缺陷等疾病的重要手段。根据骨髓来源的不同，可以将骨髓移植分为自体骨髓移植(autologous BMT)、同基因骨髓移植(syngeneicBMT)、同种异体骨髓移植(allogeneic BMT)。由于自体骨髓移植骨髓来源于自身、同基因骨髓移植的骨髓来自基因型完全相同的个体，临床上一般无明显的排斥反应，移植的成功率高，但其缺点是移植后疾病的复发率高。同种异体骨髓移植的骨髓来自基因型不同的个体，移植后常出现严重的并发症-移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)，使骨髓移植失败，导致成功率降低，但其优点是一旦移植成功，疾病的复发率低。 临床研究发现，同种异体BMT后发生GVHD的病人白血病复发率明显低于病情相似但未发生GVHD的患者，动物实验进一步证明GVHD具有抗白血病作用(graft-versus-leukemia，GVL)，能降低白血病的复发。根据这些结果，人们推测自身或同基因型BMT受者白血病复发的主要原因之一可能是无GVL作用，因此，如果在自身或同基因型骨髓移植后能诱导适度的GVHD产生GVL将可预防白血病的复发，提高治疗效果。Glazier和Bryson等先后用环孢素A(CsA)短期治疗在同基因型骨髓移植的大鼠和小鼠人工诱导出GVHD样症状，称同基因型GVHD(syngeneic GVHD，SGVHD)，令人们感兴趣的是发现SGVHD同样具有抗白血病作用。目前，自身骨髓移植 后用CsA等药物短期治疗诱导GVHD产生GVL已进入临床试验。但由于SGVHD产生的机理尚不清楚，临床上无法控制GVHD发生的强度，使其应用受到限制。我们在前期工作中，对SGVHD发生免疫机制进行了深入研究，结果发现：SGVHD鼠结肠IEL 中CD4<4+>αβT细胞明显增高，DNαβT细胞降低，二者比例失调；证实SGVHD鼠结肠IEL，细胞Thl类(IL-12、IFN-γ、TNF-α)细胞因子的表达升高；证明是CD4<+>αβT细胞而不是CD8<+>T细胞在SGVHD发生中发挥重要作用；同时发现协同刺激分子CD137在SGVHD小鼠结肠中表达升高。已知CD137和CD137L是继CD28和B7之外的另一对重要的T细胞协同刺激分子，可依赖或不依赖CD28-B7途径活化T细胞，在免疫应答、免疫调节、肿瘤免疫和自身免疫性疾病的治疗等方面发挥着举足轻重的作用，具有潜在的临床应用价值，但目前有关CD137协同刺激通路在SGVHD中的作用尚未见报道。因此本研究的目的之一是用抗CD137L抗体阻断CD137-CDl37L信号通路观察对小鼠SGVHD发生的影响，为进一步阐明SGVHD的发生机制提供新的依据，为防止自身骨髓移植后白血病的复发提供新的思路。 GVHD是同种异体骨髓移植的主要并发症，严重影响了移植的成功率，防治GVHD成为提高骨髓移植成功率的关键问题。已有的研究证实，参与GVHD的免疫细胞主要是T淋巴细胞，骨髓移植后供者T细胞在受者同种异型抗原的刺激下，活化、增殖、分化成效应性T细胞，通过释放各种细胞因子等机制引起受者组织器官的病理损伤。因此，阻断同种异型抗原反应性T细胞的活化、抑制细胞因子引起的损伤或直接抑制效应性T细胞的作用成为防治GVHD的重要策略。本研究根据GVHD的发病机制，从抑制T细胞活化、抑制效应性T细胞的作用和调节细胞因子的作用等三方面，探索了防治GVHD的新方法。(1)从抑制T细胞活化方面，我们根据T细胞活化的双信号理论及我们多年来在CD137-CD137L协同刺激通路研究的工作基础，研究了用抗-CD137L抗体阻断该通路后对同种异体骨髓移植后GVHD的影响；(2)从抑制效应性T细胞的作用方面，根据调节性T细胞(regulatory TceⅢ,Treg)研究的最新进展，建立了多次输血体内诱导受者特异性调节性T细胞产生的方法，研究了这种受者特异性Treg对效应性T细胞的抑制效应和对GVHD的影响，并在此基础上进一步探索了输入受者特异性Treg细胞和 阻断CDl37协同刺激通路对GVHD的联合抑制效应；(3)从细胞因子的调节作用方面，根据细胞因子研究的新进展，在前期研究中利用基因工程的方法，表达并纯化了新近发现的细胞因子IL-18，在本研究中进一步研究了该细胞因子在GVHD的作用(详见第二部分)。 总之，本部分研究有两个目的：一是用抗CDl37L抗体阻断CDl37-CDl37L信号通路观察对小鼠SGVHD发生的影响，为进一步阐明SGVHD的发生机制提供新的依据，为防止自身骨髓移植后白血病的复发提供新的思路；二是根据同种异型GVHD的发病机制，通过用抗CDl37L抗体阻断协同刺激通路抑制T细胞活化、通过体内诱导受者特异性调节性T细胞来抑制效应性T细胞的作用及用细胞因子IL-18抑制GVHD损伤等三方面，探索了防治GVHD的新方法，为提高骨髓移植的成功率提供新的思路。方法 一、抗CDl37L抗体在小鼠SGVHD诱导中作用的研究 (一)小鼠SGVHD模型的诱导 用致死量的X射线照射受体小鼠，4-6h内移植去Thy．1<+>T细胞的同基因型骨髓，从移植的当天开始用CsA治疗，连续21d。 (二)SGVHD的评估 停用CsA后，每周称重小鼠3次，并观察SGVHD的临床症状(体重降低、腹泻等)。取小鼠的肝脏和结肠常规制备组织切片并用H-E进行染色，然后采用双盲法由病理学家对所有的病理切片进行观察，并根据公认的标准对SGVHD进行分级。RT-PCR法检测小鼠肝脏和结肠组织中CDl37mRNA和细胞因子IL-12，IFN-γ，TNF-α mRNA水平。 (三)抗CDl37L抗体治疗 在模型建立的基础上，于移植后10d给抗体干预组小鼠腹腔注射抗CDl37L抗体进行干预治疗，每周三次，每次200μg，连续三周。然后按照上述标准观察SGVHD的发生情况。 二、抗CDl37L抗体及其联合Treg抑制小鼠aGVHD的研究 (一)抗CDl37L抗体体外对T细胞增殖的影响 以C57BL/6小鼠脾脏细胞作为反应细胞，以BALB/c小鼠脾脏细胞作 为刺激细胞进行体外混合淋巴细胞培养，在该反应体系中加入不同浓度的 抗CD137L抗体，观察抗CD137L抗体体外对T细胞增殖的影响；同时收 集培养上清液，用ELISA法检测上清夜中细胞因子IL-2的浓度。 (二)Treg的体内诱导 乙醚麻醉BALB/c小鼠，无菌操作从颈静脉采取血液，肝素防凝。然后，通过尾静脉将肝素防凝全血输入到供体小鼠C57BL/6体内，输入量为0.25ml。这种输血称为受者特异性输血(recipient specitic transfusion,RST)。每周输注一次，连续五次。部分小鼠输血一次或三次。所有接受输血的小鼠均于最后一次输血后七天处死进行以下检测：1、流式细胞术检测小鼠脾脏细胞表型 分离受血者小鼠脾脏细胞，将脾脏细胞悬浮在PBS缓冲液中，分别用．PE、PE-Cy-5标记的特异性抗体(CD25、CD4)进行双色标记。用流式细胞仪测定、分析细胞的表型。 2、RT-PCR检测Foxp3mRNA和TGF-βmRNA 用Trizol试剂抽提脾细胞总RNA，反转录成cDNA，分别用β-actin、Foxp3和TGF-β的引物进行PCR扩增。PCR产物特异性条带的OD除以来自同一组织的p-actin的OD值使其标准化后比较各自的变化。 3、Treg细胞对混合淋巴细胞反应的影响 利用单向混合淋巴细胞反应检测上述含有Treg细胞的脾脏细胞对同种异型抗原的反应程度，并检测输血次数对体外T淋巴细胞增殖反应的影响。 (三)小鼠aGVHD的建立 1.制备供体鼠骨髓细胞和脾脏细胞 颈椎关节脱臼处死供体鼠，75％乙醇浸泡10min，无菌操作分离股骨和胫骨并制备骨髓细胞；无菌操作摘取脾脏，分离脾脏细胞，两者混合作为移植细胞。 2．骨髓移植 受体鼠为BALB/c小鼠，于移植前24h接受9.0Gy的X-射线照射，然后随机分为六组：①照射组，②同基因骨髓移植组(称为对照组)，③同种异基因骨髓移植组(称为GVHD组)，④同种异基因移植抗CD137L抗体治疗组(称为GVHD+Ab组)，⑤输血处理的同种异基因骨髓移植组(称为GVHD+Treg组)，⑥输血处理的同种异基因移植抗CD137L抗体治疗组(称为GVHD+Treg+Ab组)。通过尾静脉分别注射不同的骨髓细胞和脾脏细胞。 (四)小鼠aGVHD的评价 根据参考文献标准，由高级实验师观察小鼠临床症状，由病理学专家进 行组织病理学评价。 (五)抗体治疗 按照分组要求，分别给予抗体治疗组小鼠腹腔注射抗CD137L抗体，隔日一次，连续10日。 三、统计学分析采用SPSS10.0软件对实验数据进行检验，P<0.05认为差异有统计学意义。 结果 一、抗CD137L抗体治疗可以抑制小鼠SGVHD的发生 (一)小鼠SGVHD模型建立 小鼠接受致死剂量(9.0Gy)的X射线照射后4-6h内，通过尾静脉注射同基因骨髓细胞，并于当天腹腔注射环孢素A(CsA)诱导SGVHD，连续21d。对照组小鼠均未出现SGVHD，而模型组小鼠SGVHD诱发率为67％(8/12)。 (二)CD137的检测 对照组小鼠的结肠和肝脏组织中CD137 mRNA水平较低或检测不到；SGVHD小鼠结肠和肝脏组织中CD137mRNA水平升高，两组比较P<0.05，差异具有统计学意义。 (三)抗CD137L抗体干预可降低小鼠SGVHD的诱发 上述实验结果证明，同基因骨髓移植后短期应用CsA治疗可诱导出SGVHD。于CsA诱导SGVHD的第10天起，腹腔注射抗CD137L抗体，按照模型诱导的观察指标观察抗体干预组小鼠的变化，以判断抗CD137L抗体对小鼠SGVHD的影响。结果表明，抗CD137L抗体干预治疗可减轻临床症状，如体重下降和腹泻程度减轻、活动力恢复等；可改善组织病理学改变，如小鼠结肠和肝脏组织无或仅有散在炎症细胞浸润；抗CD137L抗体可降低小鼠结肠和肝脏组织中细胞因子IL-12，IFN-Y，TNF-α和CD137mRNA的水平以及CD137mRNA的水平，与模型组小鼠相比，两组差异具有统计学意义(P<0.01)。抗CD137L抗体治疗组小鼠SGVHD的诱发率为25％(3/12)，与模型组小鼠67％(8/12)的SGVHD诱发率相比，两者差异具有统计学意义。二、抗CDl37[。抗体及其联合’rreg细胞抑制小鼠aGVHD的发生(一)抗CDl371。抗体对体外T细胞增殖的影响 1．抗CDl37[。抗体在体外可抑制混合淋巴细胞增殖反应 在单向混合淋巴细胞培养中，加入不同浓度的抗CDl37L抗体进行培养。结果显示，第 5天时，对照组中的细胞集落增大，而实验组细胞集落的扩增受到不同程度地抑制。<3>H-TdR掺入实验结果显示，第5天时lμg/ml、2.5μg/ml和5μg/ml抗CDl37L抗体可见抑制作用，但统计学分析未见显著性差异；而10μg/ml抗CDl37L抗体则可表现出明显抑制作用，并且随着浓度的增加，其抑制作用不断增强，细胞集落的增长受到明显抑制，与对照组相比，P<0.05。 2．抗CDl37IL抗体在体外可抑制细胞因子IL-2的产生 用ELISA测定上清液中IL-2的浓度显示，5d时，浓度为1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml抗CDl37L抗体组的上清液中IL-2的表达量与对照组表达量未见明显差异，而浓度为10μg/ml、20μg/ml抗-CDl37L抗体组的上清液中IL-2的表达量较对照组明显降低，差异具有统计学意义，P<0.05。 (二)抗CDl37L抗体治疗对小鼠aGVHD的影响 1．抗CDl37L抗体治疗对小鼠生存时间的影响 小鼠接受致死剂量X射线照射后进行骨髓移植，GVHD组小鼠仅存活14天，GVHD抗体治疗组小鼠则有2/5存活超过26天。 2．抗体治疗对小鼠aGVHD临床症状的改变 小鼠接受异基因骨髓移植后，由于供体T细胞识别受者细胞上的同种异型抗原而活化，引起受体鼠出现一系列GVHD临床症状，主要包括体重下降、弓背、翘毛、腹泻和活动力下降。而抗CDl37L抗体治疗组小鼠体重下降和腹泻程度减轻，活动力有所恢复等。 3．抗体治疗可以减轻小鼠结肠和肝脏组织病理学变化 H-E染色显示，GVHD模型小鼠的病理改变主要表现为：结肠组织腺上皮细胞死亡、脱落，腺体减少，炎细胞浸润，以及结肠粘膜溃疡形成、粘膜坏死脱落；肝脏组织中门静脉扩张、淤血，胆管周围淋巴细胞浸润，胆管上皮细胞死亡、脱落，血管内皮细胞炎，实质细胞凋亡等病变。而用抗CDl37L抗体治疗后，上述病理变化可明显减轻，肝脏组织中门脉扩张和淤血现象减轻、汇管区炎细胞浸润减少等。说明抗CDl37L抗体治疗可以明显改善同种异基因骨髓移植受体鼠的病理改变。 (三)Treg细胞的体内诱导及其对aGVHD的影响 1．Treg细胞的体内诱导 小鼠接受不同次数输血后可发生如下变化： (1)小鼠脾脏细胞CD4<+>CD25<+>T细胞比例升高 流式细胞仪检测结果显示，正常情况下小鼠脾脏细胞中含有一定比例的Treg细胞，大约为7.2％。输血之后，小鼠脾脏中CD4<+>CD25<+>T细胞所占CD4<+>T细胞的比例有所增加，于输血1、3、5次后，脾脏中CD4<+>CD25<+>T细胞的比例由正常时的7.2％分别升高为8.4％(P>0.05)、9.8％(P<0.01)和10.2％(P<0.01)。 (2)小鼠脾脏细胞Foxp3 mRNA的表达增加 RT-PCR显示，正常小鼠脾脏细胞表达低水平Foxp3mRNA，而经过输血后，小鼠脾脏细胞内Foxp3mRNA的表达水平升高，输血1次、3次和5次后Foxp3mRNA的水平分别是正常小鼠脾细胞的1.3(P>0.05)、2.5(P<0.01)和3(P<0.01)倍左右。 (3)小鼠混合淋巴细胞反应降低 以输血处理的C57BL/6小鼠脾脏细胞为反应细胞，以丝裂霉素处理的BALB/c小鼠脾脏细胞为刺激细胞，混合培养5天后，输血1次小鼠脾脏细胞增殖反应降低，但与正常小鼠对比未见明显差异，输血3次和5次后，小鼠脾细胞的增殖反应程度显著低下，与正常小鼠脾细胞相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。 2．Treg细胞对aGVHD的影响 以输血3次和5次的含有Treg细胞的小鼠骨髓细胞和脾脏细胞进行骨髓移植，结果显示：GVHD+Treg组小鼠第14天开始死亡，26天时的存活率为25％(1/4)，而GVHD组小鼠接受供体小鼠的骨髓细胞和脾脏细胞后仅存活14天，说明Treg细胞可以延长小鼠的短期存活时间；临床症状积分表明，GvHD+Treg组小鼠体重下降和腹泻程度减低，翘毛减少，活动力有所增加，因此症状积分明显低于GVHD组小鼠的积分；组织病理检查发现，肝脏组织门脉扩张和淤血减轻，汇管区炎细胞浸润减少；结肠组织腺上皮细胞坏死和脱落较轻，腺体结构大致正常，固有层炎细胞浸润减少等。说明Treg细胞可以改善同种异基因骨髓移植后GVHD症状，有助于免疫耐受的建立，但单独使用效果并不理想。 (四)抗CD137L抗体联合体内诱导的Treg细胞对aGVHD的影响 虽然上述试验证明单独使用抗CDl37L抗体或Treg细胞对GVHD的预防有一定的作用，但并不十分理想，因此进一步探讨抗CDl37L抗体联合体内诱导的Treg细胞对GVHD的影响非常有必要。利用含有Treg细胞的输血小鼠骨髓细胞和脾脏细胞进行骨髓移植，移植后当天给受体鼠腹腔注射抗CDl37L抗体，每只每次200μg，隔天注射一次，连续注射10次，然后观察 小鼠临床症状、生存时间，并进行组织学检查。结果显示，GVHD+Treg+Ab组小鼠于20天时开始死亡，26天时的存活率为66％(4/6)，显著高于GVHD组小鼠、GVHD+Ab组小鼠和GVHD+Treg组小鼠。其临床症状积分较GVHD组小鼠明显降低，表现为体重下降和腹泻均减轻，活动较为活泼，无弓背和翘毛现象等。组织病理学检查证实，GVHD+Treg+Ab组小鼠肝脏组织结构正常，汇管区炎细胞稀少，但门脉仍有轻微扩张；结肠组织大致结构正常，绒毛和腺体清晰可见，但在固有层仍散在炎细胞浸润。说明CDl37L抗体联合体内诱导的Treg细胞可显著减轻同种异基因骨髓移植后受体鼠的临床症状和病理变化，延长受体鼠的短期生存时间。 结论和创新性 1．目前有关CDl37协同刺激通路在SGVHD中的作用尚未见报道。本研究在国内外首先发现协同刺激分子CDl37在SGVHD小鼠结肠中高表达，并证明用抗CDl37L抗体阻断CDl37-CDl37L信号通路，可抑制小鼠SGVHD的病理损伤，为阐明SGVHD的发生机制提供新的依据，为防止自身骨髓移植后白血病复发的提供新的思路 2．根据急性同种异型骨髓移植后GVHD的发病机制，从抑制T细胞活化、抑制效应性T细胞的作用两方面探索了防治GVHD的新方法，为aGVHD的免疫治疗提供了新的途径。 (1)根据T细胞活化的双信号理论及我们多年来在CDl37-CDl37L协同刺激通路研究的工作基础，在体外证实用抗CDl37L抗体阻断CDl37-CDl37L信号通路可明显抑制混合淋巴细胞反应，抑制IL-2的产生；在体内抗CDl37L抗体治疗可改善受体鼠aGVHD的症状和组织病理变化。为用抗-CDl37抗体治疗GVHD提供了实验依据。 (2)从抑制效应性T细胞的作用方面，根据调节性T细胞(regulatory Tcelll,Treg)研究的最新进展，创新性建立了多次输血体内诱导受体特异性调节性T细胞产生的方法，初步研究显示这种受体特异性Treg可抑制效应性T细胞的作用、减轻GVHD小鼠的病理损伤、延长小鼠的生存时间。 (3)在研究阻断CDl37协同刺激通路和转输受体特异性Treg单独对GVHD抑制作用的基础上，首次运用抗CDl37L抗体联合Treg细胞干预GVHD，发现二者可以更有效地抑制小鼠同种异基因骨髓移植后aGVHD的发生。