1目的从临床与体外细胞实验两个方面观察骨关节炎患者(OA)血瘀状态、凝血-纤溶指标、生活质量、致炎/抑炎细胞因子、NF-κB信号通路、mi R-146、相关实验室指标的变化及新风胶囊对其的影响,并基于细胞NF-κB/mi R-146通路探讨新风胶囊改善骨关节炎患者血瘀状态的机制。2方法2.1理论研究通过中国知网数据库、万方数据库大量文献检索研究,分析OA患者血瘀证与中医脾虚之间的关系,总结其中医学病因病机及临床疗效,阐述OA血瘀证从脾论治的理论依据。2.2临床研究2.1.1观察60例OA患者年龄、性别、病程,关节及全身症状积分值,生活质量、心理健康积分值,疾病活动度评分及血瘀相关指标等实验室指标情况。2.1.2采用ELLSA检测白细胞介素1(IL-1)、IL-10、IL-4、IL-17、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、NF-κB激活子1(Act1)、p50、p65、TGF-P激活酶(TAK1)、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、血小板激活因子(PAF)、血小板激活因子-乙酰水解酶(PAF-AH)、无活性的血栓素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α);半定量反转录PCR检测Act1、p65、p50、TAK1、IκBα,荧光定量PCR检测外周血Act1m RNA、p65m RNA、p50m RNA、TAK1 m RNA、mi R-146;Western blot法检测p65、p50蛋白表达水平;并测定OA患者的相关实验室指标:全自动血细胞分析仪检测血小板(PLT),魏氏法检测血沉(ESR),全自动生化仪检测C反应蛋白(CRP),类风湿因子(RF),全自动凝血仪检测D-二聚体(D-D)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、部分凝血酶原时间(APTT)水平;采用问卷调查方式观察OA患者症状体征积分值(关节、全身等),生活质量、VAS积分、SF-36等积分值。采用SPSS17.0统计软件分析血瘀状态相关指标与上述指标之间的关系。2.1.3将60例住院患者按随机数字表分为实验组(新风胶囊组,30例)和对照组(氨基葡萄糖组,30例),观察两组治疗前后血瘀状态相关指标(PT、APTT、FIB、D-D、TT、PLT、PAF、PAF-AH、TBX2、6-keto-PGF1a)、关节、全身症状体征积分值,生活质量积分值,血瘀状态积分值,细胞因子、NF-κB通路指标及mi R-146的改善情况。2.2体外实验研究从所选的60例OA患者中选取5例OA患者,收集5例OA患者外周血10ml,加入适量淋巴细胞分离液,放入高速柱状离心机20℃3000R/min离心15分钟,分离出PBMC,随机分为XFC组5例、GS组5例、空白对照组5例,然后加入100 m L/L人AB血清的DMEM培养液培养,加入LPS刺激24h,然后加入转染试剂及mi R-146 mimic或mi R-146 mimic cntrol、XFC培养,然后提取RNA用于荧光定量PCR检测mi R-146表达;同时收集细胞上清,ELISA检测TNF-α和IL-1的表达水平。3结果3.1理论研究结果3.1.1骨关节炎的内外病因与“血瘀”均有密切相关;3.1.2脾气亏虚在骨关节炎血瘀状态中占有重要作用;3.1.3从脾论治在骨关节炎血瘀证治疗中的应用。3.2临床研究结果3.2.1 OA患者血瘀状态相关指标的变化与健康对照组比较,OA组各参数出现明显异常。其中,其中6-keto-PGF1a、PAF-AH明显降低,PLT、FIB、D-D、PAF、TBX2水平显著升高(P<0.05,P<0.01);PT、APTT、TT无明显改变(P>0.05)。并且相关性分析:血瘀积分与PLT、FIB、PAF、TXB2成正相关,与6-keto-PGF1a成负相关(P<0.05,P<0.01)。3.2.2 OA患者外周血致炎/抑炎细胞因子的变化与健康对照组比较,OA组血清IL-1、IL-17明显升高(P<0.05),IL-10则明显降低(P<0.05)。IL-4表达含量呈现下降趋势。3.2.3 OA患者外周血中NF-κB信号通路的相关指标表达的变化与健康对照组比较,OA组血清p50、p65、TAK1、ACT1水平显著升高(P<0.05,P<0.01)。IκBα未见明显异常。与健康对照组比较,OA患者外周血浆p50、p65蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3.2.4 OA患者外周血中mi R-146表达的变化共检测14例OA患者外周血浆的mi R-146水平,与健康对照组相比,OA患者外周血浆mi R-146表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。且mi R-146与p65、Act1呈正相关(P<0.05或P<0.01)。3.2.5 OA患者其他实验室指标的变化与健康对照组相比较,OA患者血清Ig G、ESR、Hs-CRP升高(P<0.05或P<0.01)。3.2.6 OA患者血瘀状态相关指标与细胞因子之间的关系相关性显示:IL-1与血瘀积分、PLT、TXB2成正相关,与6-keto-PGF1a成负相关;IL-17与血瘀积分、PLT、FIB、D-D、PAF成正相关,与APTT、PAF-AH成负相关;IL-4与PAF成负相关;IL-10与6-keto-PGF1a成正相关,与血瘀积分、PLT、PAF、TXB2成负相关(p<0.05,p<0.01)。3.2.7 OA患者血瘀状态相关指标与NF-κB信号通路之间的关系相关性显示:p50与血瘀积分、PLT、FIB、D-D、TXB2成正相关;p65与血瘀积分、PLT、FIB、D-D成正相关,与6-keto-PGF1a成负相关;ACT1与血瘀积分、PLT、PAF、TXB2成正相关,与6-keto-PGF1a成负相关;TAK1与TT、TXB2成正相关(p<0.05,p<0.01)。3.2.8 OA患者血瘀状态相关指标与部分实验室指标之间的关系相关性显示:ESR与血瘀积分、PLT、FIB、D-D、TXB2成正相关;Hs-CRP与血瘀积分、FIB、TXB2成正相关,与APTT、6-keto-PGF1a成负相关;Ig G与血瘀积分、PLT、FIB、D-D、PAF成正相关(p<0.05,p<0.01)。3.2.9 OA患者血瘀状态相关指标与中医脾虚症候积分、症状量化积分、Lequesne MG、SF-36各维度积分及VSA积分之间的关系相关性显示:中医脾虚症候积分与血瘀积分、PLT、D-D、TXB2成正相关,与6-keto-PGF1a成负相关;症状量化积分与血瘀积分、PLT、FIB、D-D、PAF成正相关;MG与血瘀积分、PLT、FIB成正相关,与PAF-AH成负相关;VAS与血瘀积分、PLT、FIB、D-D、TXB2成正相关,与6-keto-PGF1a成负相关(p<0.05,p<0.01)。3.2.10新风胶囊治疗OA患者的临床疗效治疗后,实验组与对照组总有效率分别为83.3%、80%,两者比较无统计学意义(P>0.05);实验组显效率(60.0%)显著高于对照组(36.7%)(P<0.05)。3.2.11新风胶囊对OA患者血瘀状态相关指标的影响与治疗前相比,XFC组治疗后血瘀积分、PLT、D-D、FIB、PAF、TXB2明显降低,PAF-AH、6-keto-PGF1a明显升高(P<0.05;P<0.05),GS组治疗后血瘀积分、PLT、D-D、PAF、TXB2明显降低,PAF-AH、6-keto-PGF1a明显升高(P<0.05;P<0.05)。而两组治疗后的PT、APTT、TT均未见明显改变(P>0.05)。与GS组治疗后相比,XFC组血瘀积分、PLT、FIB、TXB2、6-keto-PGF1a的明显改善(P<0.05)。3.2.12新风胶囊对OA患者外周血细胞因子的影响与治疗前相比,XFC组IL-4、IL-10明显升高,IL1、IL-17明显降低(P<0.05;P<0.05),与GS组相比,XFC组的IL-17明显下降(P<0.05)。3.2.13新风胶囊对OA患者外周血NF-κB信号通路相关指标表达的影响ELISA:与治疗前相比,XFC组p50、p65、ACT1明显明显降低(P<0.05;P<0.05),与GS组相比,XFC组的p65明显下降(P<0.01)。PCR:与治疗前相比,XFC组p65、p50、TAK1、Act1 m RNA明显下降(P<0.05),与GS组相比,XFC组p65、ACT1 m RNA明显下降(P<0.05)。WB:与治疗前比较,XFC组治疗后p50、p65水平明显改善(P<0.05或P<0.01);与GS对照组相比,XFC组p65明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。3.2.14新风胶囊对OA患者外周mi R-146表达的影响与治疗前相比,2组治疗后mi RNA-146水平明显改善(P<0.05或P<0.01);与GS对照组相比,两组差异无统计学意义(P>0.05)。3.2.15新风胶囊对OA患者活动性指标及实验室指标的影响两组治疗后,ESR、Hs-CRP、Ig G均有所改善(P<0.05),且两组效果无差异。3.2.16新风胶囊对OA患者症状分级、OA严重程度指数(Lequesne MG)、国际普适生活质量量表(SF-36)、VAS评分、中医5症候的影响与治疗前相比,2组症状量化积分、中医证候积分、Lequesne MG、VAS积分均明显降低(P<0.05,P<0.01),SF-36各维度积分均显著升高(P<0.05,P<0.01)。且XFC组在降低症状量化积分、中医证候积分、Lequesne MG、VAS积分,升高SF-36部分维度积分方面明显优于GS组。3.2.17新风胶囊对OA患者脾虚症候的影响与治疗前相比,XFC组患者脾虚症状各维度分值得到较好地改善(P<0.01),GS组能改善患者少气懒言及倦怠乏力的症状(P<0.01或P<0.05),在改善脾虚症状的各方面,XFC组均显著优于GS组(P<0.01)3.3体外实验研究结果3.3.1新风胶囊对OA患者单核细胞IL-1、TNF-α的分泌水平的影响OA患者外周血单核细胞培养24 h后,然后用不同浓度的XFC进行干预24 h,收集上清液,通过ELISA检测了促炎细胞因子IL-1和TNF-α水平。结果显示浓度为15nmol/L的XFC能显著抑制细胞因子的表达,后继实验均采用15nmol/L。且XFC可显著降低细胞内IL-1、TNF-α的分泌水平。3.3.2新风胶囊对OA患者单核细胞内mi R-146的影响我们用15 nmol/L XFC干预单核细胞24 h后,对mi R-146的表达进行检测,结果发现,XFC能明显诱导mi R-146表达。将LPS预刺激的PBMC转染mi R-146 mimic或mi R-146 control mimic,再加入15 nmol/L XFC干预24 h,后用ELISA检测IL-1和TNF-α分泌水平,发现转染mi R-146 control mimic的组别能够促进XFC抑制IL-1和TNF-α表达的作用。4结论4.1 OA患者血瘀相关指标出现异常,其中6-keto-PGF1a、PAF-AH水平降低,PLT、FIB、D-D、PAF、TBX2水平升高,说明OA患者的病变中,确实存在血瘀状态。4.2 OA患者血瘀状态相关指标的改变可能与细胞因子的失衡,NF-κB的异常活化及mi R-146的低表达相关,并与关节、全身症状体征、生理功能、实验室指标(Ig G、CRP、ESR等)亦密切相关。说明OA不但引起关节的肿痛、畸形、活动不利,而且还可导致血瘀状态相关指标的异常改变,以及改善在此基础上生理和全身整体功能障碍。4.3 XFC在减轻OA患者关节局部症状的同时,也能通过改善血瘀状态,更加全面地改善胸闷、食欲减退等全身症状,降低CRP、ESR等炎症活动性指标,提高患者生活质量。4.4新风胶囊改善OA血瘀状态的机制4.4.1改善血瘀状态相关指标;4.4.2上调抑炎因子,下调致炎因子,阻止其对凝血系统的影响,及其对骨质的破坏;4.4.3调节NF-κB信号的表达,防止其异常活化,保护血管内皮;4.4.4调节mi R-146的表达。