肠球菌(Enterococcus)是一种在自然界普遍存在的革兰阳性球菌,也是人和动物肠道的主要菌群。目前,肠球菌属的细菌种类以达到41种,但粪肠球菌(E.faecelis)和屎肠球菌仍是各种介质中主要存在的优势种群。肠球菌在医院内细菌感染中占有重要的位置,可引起人腹膜炎、心内膜炎、尿道炎和脑膜炎等,但近年来,肠球菌对动物感染的报道也越来越多,不但可引起羔羊的脑炎,鸡和鸭的败血症,还可引起猪的败血症、关节炎和脑膜炎。2003～2007年期间,在河南省洛阳、济源、许昌、南阳、三门峡等地送检病猪的血液、肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结、脑组织、关节液等分离到42株疑似肠球菌,并通过常规和分子生物学方法鉴定到种的水平,其中粪肠球菌12株,屎肠球菌30株。为了进一步研究肠球菌对猪感染的致病机理和为以后的免疫和血清学诊断建立基础,我们又从郑州市各集贸市场市售新鲜猪肉和猪粪便中分别分离了12株和14株肠球菌,对包括感染猪的42株肠球菌在内的68株细菌进行了毒力因子的表型和基因型测定、动物实验,并对肠球菌的主要毒力因子cylA基因进行克隆和原核表达,所有研究内容都取得了预期的初步结果。细胞溶解素(cyl)和明胶酶是肠球菌的两种主要致病因子,也是临床检查肠球菌致病性两个主要特征。我们对68株猪源肠球菌在兔鲜血平板和明胶琼脂平板溶血和溶解情况进行了测定,发现感染性菌株具有较高的比率,其中,粪肠球菌β溶血91.7%、明胶溶解100%。cylA、gelE、efaA、esp、AS和ace被认为是肠球菌的主要致病基因,我们分别设计了6对引物利用PCR技术检测了68株肠球菌的6种致病基因。根据检测结果:感染猪的肠球菌携带有较高比率致病基因,食品和猪粪便肠球菌携带的致病基因相对较低,而食品中肠球菌较粪便中肠球菌携带的较高;通过比较分离到的两种肠球菌携带的致病基因,发现不管是感染猪的肠球菌,还是食品或猪粪便中肠球菌,粪肠球菌均携带有较高比率的致病基因。在6种致病基因中,感染猪的致病株cylA(100%)、gelE(100%)和efaA(100%)检出率最高,这说明这三种毒力基因可能发挥主要致病作用。动物模型的建立是研究病原菌的致病机理、临床治疗效果、新药开发和评价病原菌毒力大小的有效手段。肠球菌为一机会性病原体,而且其致病能力是包括了许多毒力因子在内的复杂过程,临床上主要通过测定其表型来判断其毒力高低,如检测其溶血性和明胶溶解试验,但对于同时存在这两种表型的菌株的毒力则无从判断。而且由于肠球菌致病性较弱,直接用肠球菌感染小鼠往往需要较大的细菌数量,且也不易判断不同菌株致病性梯度大小关系,我们应用鼠粪萃取物(SRFE)按20%浓度添加到各粪肠球菌的菌液中,选择5株携带有不同毒力基因粪肠球菌,通过测定各菌株的LD50,成功构建了粪肠球菌的腹膜炎致病模型,HE1和HE5携带全部6种毒力基因,这两株粪肠球菌对小鼠的LD50分别为106.01CFU和106.17CFU;HE41仅含有4个毒力基因,缺少esp和AS,HE41的LD50为107.17CFU;HE9和HE10都含有5个毒力基因,HE9缺少ace,HE10缺少AS,而它们对小鼠的LD50分别为107.01CFU和106.51CFU。cylA是肠球菌细胞溶解素的激活蛋白基因,根据猪源肠球菌溶血素基因设计表达引物,扩增出两端带有XhoI和HindⅢ酶切位点的cylA蛋白基因,亚克隆到原核表达载体pET32a中构建了重组表达质粒pET32a-cylA,在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为65.9 KD的融合蛋白cylA-His,与预期结果相符。为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定了基础。