目的:模拟椎间盘组织结构和功能,构建具有生物学活性的组织工程椎间盘,初步评价其在体内的生物学功能。方法:(1)取3周龄新西兰大白兔椎间盘组织,利用Ⅱ型胶原酶消化法分别获取髓核细胞和纤维环细胞,观察鉴定第二代(P2)细胞。(2)利用交联反应制备的壳聚糖水凝胶作为髓核支架,利用静电纺丝技术制备的聚对苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯[poly(butylene succinate-co-terephthalate),PBST]纺丝薄膜作为内纤维环支架,以实心的PBST环作为外纤维环支架。采用扫描电镜表征壳聚糖水凝胶和PBST纺丝薄膜的空间结构,测试PBST纺丝薄膜的孔隙率及吸水率。(3)在壳聚糖水凝胶、PBST纺丝薄膜上分别接种髓核细胞和纤维环细胞,培养3W后,HE染色检测支架的细胞相容性。(4)以壳聚糖水凝胶作为髓核支架,PBST纺丝薄膜作为内纤维环支架,实心的PBST环作为外纤维环支架,组装成PBST/壳聚糖水凝胶三相组织工程椎间盘支架,检测三相组织工程椎间盘支架的力学性能。(5)将P2代纤维环细胞、髓核细胞分别接种在纤维环、髓核支架上,再移至裸鼠皮下培养;4W后,通过HE、番红-O、CollagenⅡ免疫组化、Aggrecan免疫荧光染色观察组织工程椎间盘的形态结构和II型胶原蛋白、蛋白聚糖的表达。(6)用上述裸鼠皮下培养的组织工程椎间盘置换3月龄新西兰大白兔的椎间盘,钢板固定相邻椎体。术后4W行X线、MRI检测并获取组织工程椎间盘标本,通过HE、番红-O、CollagenⅡ免疫组化、Aggrecan免疫荧光染色观察组织工程椎间盘的形态结构和II型胶原蛋白、蛋白聚糖的表达。(7)提取裸鼠皮下组织工程椎间盘(裸鼠组)、实验兔体内组织工程椎间盘(实验兔组)、兔正常椎间盘(对照组)的RNA,体外扩增CollagenⅡ、Aggrecan基因,RT-PCR检测II型胶原蛋白及蛋白聚糖的表达。结果:(1)体外培养的P2代纤维环细胞、髓核细胞在形态上呈长梭形或多边形,生长速度快。两种细胞的番红-O、CollagenⅡ免疫组化、Aggrecan(蛋白聚糖)免疫荧光染色均呈阳性,表明细胞分泌Ⅱ型胶原、蛋白聚糖。(2)壳聚糖水凝胶呈白色海绵状,吸水后呈透明胶冻状,扫描电镜见支架存在大量孔隙,孔隙之间相互连通。接种髓核细胞体外培养3W后,HE染色可见细胞在支架内生长良好,细胞分布均匀。(3)光镜下见PBST纤维粗细均匀,无珠状体形成;PBST纺丝薄膜呈白色,较疏松,孔隙率为61.83%±7.33%,吸水率为297.34%±57.13%;复合纤维环细胞体外培养3W后的PBST纺丝薄膜HE染色可见纤维环细胞在PBST纺丝薄膜内分布均匀,细胞大量增殖。(4)组装的三相组织工程椎间盘支架大小约9×5×2 mm,各相之间连接紧密,无明显缝隙;压缩强度为3.10MPa±0.13MPa,弹性模量为22.22 Mpa±0.92Mpa;拉伸强度为3.21MPa±0.18MPa,弹性模量为18.13MPa±1.30MPa。(5)裸鼠皮下构建的组织工程椎间盘具有与正常椎间盘相似的结构,各相之间融合良好,种子细胞在组织工程椎间盘内分泌Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。(6)X线检测见钢板内固定位置良好,无断裂、移位,椎间隙高度正常;MRI检测见组织工程椎间盘T2相为高信号。(7)术后4W解剖实验兔,组织工程椎间盘在椎间隙位置良好,形态完整,无移位、碎裂;组织工程椎间盘的HE染色见大量细胞,番红-O、CollagenⅡ免疫组化、Aggrecan免疫荧光染色阳性,表明组织工程椎间盘含有Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。(8)RT-PCR:CollagenⅡm RNA的表达:对照组高于实验兔组,P=0.001,差异具有统计学意义;对照组高于裸鼠组,P=0.000,差异具有统计学意义。Aggrecan m RNA的表达:对照组高于实验兔组,P=0.000,差异具有统计学意义;对照组高于裸鼠组,P=0.000,差异具有统计学意义;裸鼠组高于实验兔组,P=0.000,差异具有统计学意义。结论:(1)PBST/壳聚糖三相组织工程椎间盘支架材料符合正常椎间盘的结构特点,具有良好的细胞相容性、孔隙率、力学性能和可塑性。(2)在裸鼠皮下构建的组织工程椎间盘各相之间融合良好,形态学观察、组织结构特点与正常椎间盘相似,具有细胞生物活性。(3)采用钢板固定相邻上下椎体的固定方式可靠。组织工程椎间盘在体内继续保持细胞活性,分泌椎间盘细胞外基质,部分发挥椎间盘的生物学功能。(4)本实验可为组织工程椎间盘构建提供理论依据。