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研究背景周围神经损伤也叫做PNI，它是一种十分常见的临床损伤症状。最近几年，伴随着现代建筑工业、交通业不断发展，周围神经损伤发病人群数量逐渐增加。美国临床医学研究发现，每年都有超过5万起周围神经损伤病例；而在我国，每年都要增加60万到90万周围神经损伤病例[1]。另外，和其他组织细胞相比，神经元在发育成熟阶段无法自行分裂、复制，一旦出现损伤，如果不及时救治很可能造成损伤扩大甚至会失去肌肉运动、感觉功能，从而导致永久残疾瘫痪[2]。这对于病患们的身体及心理健康造成极大伤害，严重降低了病患的生活质量。现阶段，周围神经损伤治疗理论依据主要是周围神经可再生理论，创造神经纤维再生环境，提供相应的神经成长因子和细胞元素，使得受损神经再次生长发育，但并没有使神经快速连接人体感受器、效应器。为解决这一问题，本文提出了“桥接神经元修复周围神经损伤”的治疗方法，就是利用神经元进行连接传递，使得神经快速连接到人体感受器、效应器，缓解机体病变症状，从而达到良好修复治疗效果。目的1、从家兔身上抽取骨髓，并进行培养保存，将家兔骨髓源性神经组织定向干细胞（简称为NTCSC）作为母体细胞，运用免疫荧光细胞化学鉴定法，判断其是否属于神经干细胞。2、对NTCSC进行分离鉴定，在此基础上培养第三代干细胞，并转染其携带的GFP慢病毒，最后获得携带GFP病毒的NTCSC。3、促使携带GFP病毒的NTCSC分化为神经元细胞，培养出能够进行移植的干细胞源性神经元细胞。4、设置脱细胞神经支架，建立神经再生培养室。5、通过神经支架培育干细胞源性神经元细胞，在体外形成满足移植条件的工程化神经元组织。6、在体外培养满足移植条件的工程化神经元组织，认真观察神经支架上的细胞变化情况以及工程化神经元组织的电生理特性。7、研究工程化神经元组织移植体，观察受损周围神经中GFP转染骨髓神经元细胞存活情况，分析工程化神经元组织对于周围神经损伤的修复效果。方法1、本研究中的骨髓样本取自于三个月大的家兔，从家兔胫骨平台下抽取2到3毫升骨髓，将家兔骨髓源性神经组织定向干细胞（NTCSC）作为母体细胞。2、对骨髓神经组织干细胞溶液进行分离培养，等到细胞融合程度达到80%，然后进行传代培养，最终获得第三代NTCSC。接着在新的干细胞溶液中加入10μL浓度为1.5×109pfu/L的GFP慢病毒悬液，将GFP病毒转染到第三代NTCSC上，从而获得携带GFP病毒的NTCSC。3、在感染GFP病毒的NTCSC培养基中加入2000nmol/L的RA诱导剂和500ng/mL的SHH诱导剂，促使母体细胞分为化神经元细胞。4、选用长度为10厘米的医学硅胶管，把它放到零下80度的冰箱中进行冷冻，然后取出干燥成形的硅胶管制成胶原-壳聚糖支架。然后从家兔坐骨神经上剪掉0.5厘米，让神经组织自然回缩，出现1.5厘米的神经缺损，接着用清洁硅胶管缝接受损神经两端，获得实验动物模型。5、制作20个家兔坐骨神经1.5厘米缺损的实验模型，10个自体神经移植模型。30只家兔随机平均分为三组，进行实验研究。实验1组(采用空支架移植)：从家兔坐骨神经上剪掉0.5厘米，让神经组织自然回缩，出现1.5厘米的神经缺损，把细胞支架和坐骨神经缺损两端进行缝合，沿纵轴放入微量注射器，以1.5毫米为间隔，选取11个注射点，把160μL细胞悬液分散注入脱细胞神经支架。实验2组（采用细胞支架）：把浓度为107细胞数/ml的NTCSC神经细胞悬液，用微量注射器抽取160μL的细胞悬液，方法和上面相同。实验3组（采用神经移植）：从家兔身上截取1.5厘米的坐骨神经，把神经两头调换后重新缝合。6、在体外培养满足移植条件的工程化神经元组织，认真观察神经支架上的细胞变化情况以及工程化神经元组织的电生理特性。通过研究体内工程化神经元组织移植体，在细胞移植4周后进行动物行为学检测，8周后进行肌肉力量检测，12周后进行肌电图分析。对受损周围神经中感染GFP病毒的骨髓神经元样本细胞存活情况进行观察分析，探讨“桥接神经元修复周围神经损伤”治疗方法可行性，评价分析工程化神经元组织对于受损周围神经的修复治疗效果。结果1、通过观察脱细胞神经支架中移植细胞生长、分化情况发现：神经元细胞的NTCSC可以在神经支架上培育存活，并且成片均匀分布，生长势头良好。细胞液充足，细胞膜完整光滑，可以清晰看到细胞核轮廓。这表明NTCSC通过脱细胞神经支架顺利实现移植，母体细胞在移植环境中能够正常存活。通过免疫组织化学检测发现：Nestin阳性细胞利用脱细胞神经支架顺利完成移植，并保持神经前体细胞在一段时间内结构稳定，实现自我更新。另外，通过电镜观察支架内移植细胞发现，这些移植细胞有一定功能结构。移植细胞电生理检测结果显示：神经元细胞移植体经过8周体外培养后开始显现出电生理性质，从总体上看，脱细胞神经支架中的移植细胞都可以正常生长、分化，移植效果良好。2、通过观察体内移植细胞生长情况发现：实验家兔基本可以正常行走，肌肉力量良好，工程化神经元组织能够快速传导连接，实验家兔肌肉中含有大量蛋白质，经过HRP逆行示踪检测、透射电镜检测、免疫荧光组织化学检测后，我们发现，家兔受损坐骨神经中植入的NTCSC神经元存活状况良好。结论通过观察体内移植细胞生长情况发现：实验家兔基本可以正常行走，肌肉力量良好，工程化神经元组织能够快速传导连接，实验家兔肌肉中含有大量蛋白质，经过HRP逆行示踪检测、透射电镜检测、免疫荧光组织化学检测后，我们发现，家兔受损坐骨神经中植入的NTCSC神经元存活状况良好。