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研究目的:1.探讨西达本胺(chidamide)是否能够替代利妥昔单抗(rituximab,R),增强利妥昔单抗耐药的弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)细胞系对CHOP治疗的敏感性,为弥漫大B细胞淋巴瘤的个体化和精准治疗提供新思路。2.探究西达本胺联合CHOP对利妥昔单抗耐药的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系的作用及相关分子机制。研究方法:1.通过MTT法检测CHOP、利妥昔单抗、西达本胺对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞活力的影响:首先采用不同浓度的西达本胺分别处理Su-DHL-8、Su-DHL-6、OCI-Ly3、OCI-Ly7细胞,于24h、48h、72h后,选择MTT比色法检测细胞活力的变化。然后用CHOP、利妥昔单抗、CHOP+利妥昔单抗、西达本胺、CHOP+西达本胺分别处理上述弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系24h,选择MTT比色法检测各组细胞活力的变化。2.运用Calcu Syn软件计算CHOP联合西达本胺治疗利妥昔单抗耐药的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的联合指数(combination index,CI)。3.在体内构建利妥昔单抗耐药的小鼠移植瘤模型,验证CHOP联合西达本胺在弥漫大B细胞淋巴瘤中是否具有协同抗肿瘤作用。4.采用流式细胞术检测细胞凋亡率的变化:将实验分设为六组:对照组、CHOP组、rituximab组、CHOP+rituximab组、西达本胺组、CHOP+西达本胺组。对照组:不做处理;CHOP组:10μg/ml CHOP孵育OCI-Ly7细胞24h;rituximab组:10μg/ml rituximab孵育OCI-Ly7细胞24h;CHOP+rituximab组:10μg/ml CHOP+10μg/ml rituximab孵育OCI-Ly7细胞24h;西达本胺组:5μmol/L西达本胺孵育OCI-Ly7细胞24h;CHOP+西达本胺组:10μg/ml CHOP+5μmol/L西达本胺孵育OCI-Ly7细胞24h。收集细胞AnnexinⅤ/PI染色后上流式仪检测各组的细胞凋亡率。5.采用蛋白免疫印迹法(Western bloting)检测凋亡相关蛋白表达水平:通过不同的处理24h后收集细胞,采用Western bloting检测AKT/P-AKT、BAD/P-BAD、Bcl-2、P21、PARP/c-PARP和caspase-3/c-caspase3的表达水平。研究结果:1.根据MTT实验结果可知:不同浓度(1μM、5μM、10μM、15μM、20μM)的西达本胺处理细胞24h,Su-DHL-8、Su-DHL-6、OCI-Ly3、OCI-Ly7细胞的IC50分别为25.88μM、28.87μM、19.7μM、16.85μM。不同浓度(1μM、5μM、10μM、15μM、20μM)的西达本胺处理细胞48h,Su-DHL-8、SuDHL-6、OCI-Ly3、OCI-Ly7细胞的IC50分别为19.96μM、22.63μM、13.54μM、10.79μM。不同浓度(1μM、5μM、10μM、15μM、20μM)的西达本胺处理细胞72h,Su-DHL-8、Su-DHL-6、OCI-Ly3、OCI-Ly7细胞的IC50分别为8.76μM、10.93μM、4.92μM、2.97μM。由此可得,西达本胺随时间、浓度梯度促进弥漫大B细胞淋巴瘤细胞死亡,且OCI-Ly3和OCI-Ly7细胞系对西达本胺更敏感。2.用CHOP、利妥昔单抗、CHOP+利妥昔单抗、西达本胺、CHOP+西达本胺分别处理四种弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系24h,将各实验组的结果对比发现,在Su-DHL-8和Su-DHL-6细胞系中,rituximab能明显提高CHOP对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的抑制作用,西达本胺及西达本胺联合CHOP也能促进弥漫大B细胞淋巴瘤细胞死亡,但R-CHOP效果更好,所以对R敏感的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞仍然选择标准治疗RCHOP;在OCI-Ly3和OCI-Ly7细胞系中,R对CHOP无明显的增敏作用,西达本胺及其联合CHOP治疗能显著促进弥漫大B细胞淋巴瘤细胞死亡,且西达本胺联合CHOP的治疗效果明显优于标准治疗R-CHOP,所以对R耐药的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞可考虑选择西达本胺联合CHOP来治疗。3.根据Calcu Syn软件计算的两药联合的联合指数可得:西达本胺联合CHOP对治疗利妥昔单抗耐药的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞具有协同抗肿瘤的作用。4.通过构建利妥昔单抗耐药的小鼠移植瘤模型,验证了西达本胺可以增强CHOP治疗的敏感性。5.流式细胞术检测细胞凋亡的实验结果显示:在OCI-Ly7细胞系中,CHOP可以促进弥漫大B细胞淋巴瘤细胞凋亡,联合西达本胺后凋亡率显著增加,而联合利妥昔单抗后凋亡率无明显增加。6.Western bloting的实验结果显示:西达本胺可以激活caspase-3和PARP,下调Bcl-2分子、抑制P-AKT和P-BAD的表达以及促进P21的表达,从而促进弥漫大B细胞淋巴瘤细胞凋亡。研究结论:1.对利妥昔单抗治疗敏感的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞,我们仍然选择标准治疗方案R+CHOP。2.对利妥昔单抗耐药的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞,西达本胺可增敏CHOP对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用,两药联合具有很好的协同抗肿瘤作用,主要体现在促凋亡作用的增强。3.西达本胺促进弥漫大B细胞淋巴瘤细胞凋亡的作用可能是通过抑制AKT/BAD信号通路以及下调Bcl-2分子发挥作用的。