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第一部分密码子优化的霍乱肠毒素B亚单位DNA疫苗的免疫原性及保护作用研究目的:构建密码子优化的霍乱肠毒素B亚单位(CTB)DNA疫苗,并研究其免疫原性以及诱导的保护性免疫应答。方法:根据CTB氨基酸序列资料,按哺乳动物细胞和大肠杆菌偏好的密码子对CTB基因序列进行密码子优化合成优化基因,优化的基因既可用于在哺乳动物细胞表达,也可在大肠杆菌中的表达。然后,将密码子优化的CTB基因克隆到核酸疫苗载体pJW4303,构建CTB DNA疫苗。用CTB DNA疫苗转染293T细胞,通过蛋白质免疫印迹法检测转染细胞中CTB蛋白的表达。在此基础上,采用肌肉注射+活体基因导入方式免疫,用CTB DNA疫苗免疫新西兰兔和Balb/c小鼠。兔免疫的时间点为第0、2、4和8周,而小鼠于第0和2周进行免疫。于免疫前和每次免疫后两周收集血清和粪便标本,通过ELISA方法检测免疫后小鼠和兔血清及粪便中CTB特异性IgG抗体应答。用乳鼠保护试验检测免疫兔血清对致病性O1群霍乱弧菌Eltor生物型菌株的的被动保护作用,免疫兔肠段结扎试验验证CTB DNA疫苗免疫产生的主动保护作用。结果:构建的密码子优化的CTB DNA疫苗,能正确表达CTB蛋白。CTB DNA疫苗免疫家兔和小鼠后,不仅可以血清中能产生较高水平的CTB特异性的抗体,而且粪便中也能检测到CTB特异性IgG抗体应答。乳鼠保护试验和兔肠段结扎试验表明,CTB DNA疫苗免疫后,可以诱导机体产生保护性免疫反应。结论:密码子优化的CTB DNA疫苗具有良好的免疫原性,在动物体内能诱导产生保护性免疫应答。第二部分CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗胃肠道外加强诱导系统性和粘膜抗体应答的研究目的:研究霍乱CTB DNA疫苗初免和灭活全菌体/霍乱肠毒素B亚单位(KWC-B)疫苗胃肠道外加强联合免疫诱导的系统性和粘膜抗体应答。方法:Balb/c小鼠于第0和2周免疫两次,分别接受同源的DNA初免+DNA加强(DNA+DNA),KWC-B初免+ KWC-B加强(KWC-B+KWC-B),或者异源性DNA初免+ KWC-B加强(DNA+KWC-B)。DNA疫苗通过肌肉注射、活体基因导入免疫,KWC-B肌肉注射。免疫前和免疫后2周采血和收集小鼠粪便。ELISA方法检测免疫血清和粪便中CTB特异性IgG、IgA和IgM抗体应答以及血清中CTB特异性IgG抗体亚型。第二次免疫后5个月处死小鼠,分离脾细胞,通过ELISPOT检测CTB特异性IgG抗体分泌细胞。结果:KWC-B疫苗一次肌肉注射免疫不能诱导血清高水平IgG、IgA和IgM抗体应答,粪便中不能检测到抗体应答。两次免疫后,小鼠接受CTB DNA疫苗单独免疫,KWC-B疫苗单独免疫,或CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗加强组血清中均产生了高水平的抗体应答,粪便中也检测到IgG。KWC-B单独免疫诱导以IgG1为主,Th2型抗体应答,而DNA疫苗单独免疫诱导较好IgG2a,Th1型抗体应答。有趣的是,CTB DNA疫苗初免出现更平衡的IgG1和IgG2a,更加平衡的Th1/Th2应答。所有接受两次免疫的组别检测到CTB特异性抗体分泌细胞。结论:CTB DNA疫苗单独免疫,KWC-B(IM)单独免疫,或CTB DNA疫苗初免-KWC-B疫苗(IM)强联合免疫组小鼠均诱导抗CTB的系统性和粘膜抗体应答。然而,CTB DNA疫苗初免-KWC-B疫苗(IM)加强诱导更加平衡的Th1/Th2抗体应答。第三部分CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗口服加强诱导系统性和粘膜抗体应答的研究目的:研究霍乱CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗口服加强联合免疫诱导的系统性和粘膜抗体应答。方法: Balb/c小鼠于第0和2周免疫,分别接受同源的DNA初免+DNA加强(DNA+DNA),KWC-B初免+ KWC-B加强(KWC-B(O)+KWC-B(O)),或者异源性DNA初免+ KWC-B加强(DNA+KWC-B(O))。DNA疫苗通过肌肉注射、活体基因导入免疫,KWC-B疫苗经口免疫。免疫前和免疫后2周采血和收集小鼠粪便。ELISA方法检测免疫血清和粪便中CTB特异性IgG、IgA和IgM抗体应答以及血清中CTB特异性IgG抗体亚型。第二次免疫后5个月处死小鼠,分离脾细胞,通过ELISPOT检测CTB特异性IgG抗体分泌细胞。结果:KWC-B疫苗口服一次免疫未能诱导血清和粪便特异性抗体应答。两次免疫后, CTB DNA疫苗单独免疫组,或CTB DNA疫苗初免及KWC-B疫苗口服加强组小鼠血清中产生了高水平的抗体应答(IgG、IgA和IgM)。KWC-B疫苗单独口服组粪便中仅检测到IgA,而DNA疫苗单独免疫组仅检测到IgG。有趣的是,接受CTB DNA疫苗初免及KWC-B口服加强组粪便中检测到IgA和IgG应答。第二次免疫后5个月,CTB特异性抗体分泌细胞仅在CTB DNA疫苗单独免疫组,及CTB DNA初免+KWC-B口服加强组检测到,KWC-B单独免疫组未检测到。结论:虽然KWC-B口服免疫诱导粘膜抗体的应答,但是不能诱导系统性抗体应答。与DNA单独免疫或KWC-B单独免疫相比,CTB DNA初免+KWC-B口服加强诱导更强的系统性和粘膜抗体应答。