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背景及目的在中国恶性肿瘤发病的疾病谱中,结直肠癌位列第3位。在中老年群体中,该病的发病率呈快速上升的趋势。在过去的十年中,伴随着结直肠癌预防、诊断和治疗技术的进展,对于初次诊断为早期结直肠癌的患者,其5年的生存率已经显著改善;然而面向全体结直肠癌患者的统计数据显示,我国结直肠癌患者的5年生存率较发达国家仍然有很大的差距,究其原因与该肿瘤发病的分子机制不明确有关。因而,积极开展针对结直肠癌组织增殖、转移及凋亡的分子生物学研究,确定疾病的发病机制,是指导疾病早期诊断、治疗及改善预后的关键。长链非编码RNAs(lncRNAs)长度为200-10’000个核苷酸。它们不具备编码蛋白的能力。大量的研究表明,lncRNAs在多种肿瘤中均存在一异常表达。SNHG5是核仁小分子非编码RNA(Small nucleolar RNA,snoRNA)宿主基因家族成员之一,其长度为524个碱基对,定位于6q15染色体易位的断裂点。以往的研究表明,SNHG5与B细胞淋巴瘤有一定相关性。SNHG5分别编码内因子4、5的核仁小RNA U50、U500。在乳腺癌及前列腺癌中,躯体及生殖细胞系中U50突变均已有相关报道。然而SNHG5在CRC中的机制尚未被证实。MicroRNA(miRNA)是一类长度为19-25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,参与介导20-30%的蛋白表达。近几年,许多miRNA被证实可通过调节mRNA表达,参与并促进肿瘤发病。大量前期研究已证实MiR-132定位于17p13.3染色体。以往关于神经胶质瘤、CRC、乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤的研究,均提示MiRNA-132与SNHG5存在相关性。MiRNA可能为SNHG5潜在的作用靶点。一些研究提示miR-132能够促进肿瘤细胞的增殖。此外,在神经元相关疾病中以及其他诸如炎症反应及细胞转化等领域,MiR-132均发挥了重要作用。CAMP反应元件结合蛋白5(CREB5)是cAMP反应元件结合蛋白家族的成员,包含锌指结构域及bZIP DNA结合结构域。前期研究显示,在肺癌患者中,CREB5的表达预示与患者无病生存期有相关性。然而,CREB5与结直肠癌起病是否存在相关性,以及两者基因水平相互作用的机制尚未被证实。参考以上文献的复习及生物信息学预测的结果,我们确立了“LncRNA SNHG5通过mi-132-3p/CREB5对结直肠癌增殖、转移和迁移的影响”这一课题,研究目的为观察lncRNA SNHG5在结直肠癌中的生物学功能,并探讨SNHG5调控CRC的机制,从而指导结直肠癌诊治。方法1.用R语言统计软件对GPL96平台上的GSE18105基因芯片进行统计分析,筛选表达异常的lncRNA,结合检索到的相关文献,选择SNHG5为研究目标。应用qRT-PCR法检测肿瘤组织中SNHG5的表达水平,并与癌旁组织进行比较。应用qRT-PCR法检测CRC细胞系RKO,SW480,LoVo以及正常结肠组织中SNHG5的表达,最终选取SNHG5表达水平较高的CRC细胞系进行随后的实验。2.通过检索星基数据库,我们发现miR-132-3p,miR-155,miR-205及miR-150与SNHG5之间存在相互作用。LoVo细胞系转染si-SNHG5后,用qRT-PCR检测以上相关miRNA的表达水平。选择表达水平最高的miR-132-3p,应用qRT-PCR法检测其在肿瘤组织与癌旁组织中的表达。通过荧光素酶报告基因及qRT-PCR法检测miR-132-3p与SNHG5在对方表达下调及增强时的表达水平,进而明确两者的相互作用。3.将细胞分成 5 组:miR-132-3p 增强组(miR-132-3p mimics group)、miR-132-3p 抑制组(miR-132-3p inhibitor group)、SNHG5 基因敲除组(si-SNHG5 group)、SNHG5 基因敲除+miR-132-3p 抑制组(si-SNHG5+miR-132-3p inhibitor group)及对照组(NC group)。用 qRT-PCR、CCK-8 assay、transwell assay 和wound healing assay等检测手段评估SNHG5、miR-132-3p对CRC细胞增殖、转移和迁徙的影响。4.用流式细胞术检测以上5组中CRC细胞的凋亡率,确定SNHG5对CRC细胞凋亡的作用。5.分析肿瘤与正常组织中mRNA的水平,差异倍数大于2的用于绘制热图。选取CREB5作为研究对象,应用Western blotting和qRT-PCR确认CREB5在肿瘤及癌旁组织中的表达。6.miR-132-3p and CREB5之间的关系:生物信息学软件(Targetscan 7.1)预测miR-132-3p的作用靶点可能为CREB5。荧光素酶活性分析:miR-132-3p表达增强后转染CREB5-wt/CREB5-mut的CRC细胞中CREB5的表达,评价两者能否直接结合。CRC 细胞转染转染“miR-132-3p inhibitior 及 miR-132-3p mimics”后,用western blot和qRT-PCR测定CREB5在mRNA和蛋白水平的表达,以确定miR-132-3p能否抑制CREB5表达。7.评估miR-132-3p能否通过靶向作用于CREB5对CRC细胞增殖、转移、迁徙、凋亡的产生影响:将细胞分为4组:CREB5组,si-CREB5组,CREB5+miR-132-3p增强组,对照组。应用qRT-PCR检测CREB5表达。应用CCK8、转板迁移测定法(Transwell migration assay)及伤口愈合分析(wound healing assay)检测各组LoVo细胞的增殖能力。对于LoVo细胞凋亡率,选择流式细胞术进行测定。8.体内实验证实lncRNA SNHG5对CRC的作用:试验分为2组:si-SNHG5组和对照组。将肿瘤细胞植入裸鼠皮下,饲养过程中测量肿瘤的大小;在饲养25天后被处死,取出小鼠皮下的肿瘤,分别用游标卡尺测量大小,用天平称量重量。应用Western blot,测定两组中CREB5的表达水平。9.LncRNA SNHG5及miR-132-3p对CRC细胞中CREB蛋白家族的作用:应用Western blot测定以上两组中蛋白的表达。应用miR-132抑制/增强治疗后,测定CREB1及CREB3的变化趋势。结果1.LncRNA SNHG5在CRC组织和细胞中呈过表达。基因芯片分析提示SNHG5在肿瘤中表达水平为癌旁组织的2.79倍。应用qRT-PCR检测肿瘤组织及癌旁组织中SNHG5的表达,并进行比较,结果有统计学意义。比较SNHG5在结直肠癌细胞系RKO、SW480、LoVo中和正常结直肠细胞FHC中的水平,结果显示:SNHG5在结直肠癌细胞中的表达上调,其中LoVo细胞表达水平最高。2.MiR-132-3p和SNHG5的关系:MiR-132-3p在CRC细胞中的表达显著低于正常组织。在CRC细胞中,增强miR-132-3p的表达后,转染SNHG5野生型的细胞荧光素酶活性受到抑制,而在转染SNHG5变异株的细胞中则没有变化,提示SNHG5可以直接结合到miR-132-3p的3’端非编码区域进而抑制其表达。在转录水平,转染miR-132-3p mimics组和NC组,SNHG5的表达水平无明显差异,提示两者之间为单向调节。MiR-132-3p与SNHG5表达呈负相关。综上,在CRC细胞中miR-132-3p是SNHG5的下游靶点。3.SNHG5通过靶向调控miR-132-3p对CRC细胞增殖、转移及迁徙的影响:CCK8实验显示LoVo细胞系转染miR-132-3p inhibitor后增殖能力明显强于对照组,而miR-132-3p mimics组及si-SNHG5组较对照组减弱。细胞迁移实验(Transwell assay)和伤口愈合试验(wound healing assay)评价肿瘤转移及迁徙能力:与对照组相比,转染miR-132-3p inhibitor组转移及迁徙能力显著增强,而miR-132-3p mimics 及 si-SNHG5 组被抑制。SNHG5 通过调控 miR-132-3p 促进CRC细胞的增殖、转移和迁徙。4.SNHG5 通过调控 miR-132-3p 对 CRC 细胞凋亡的影响:miR-132-3p mimics组和si-SNHG5组凋亡率显著增加;而miR-132-3p inhibitor组被显著抑制,si-SNHG5+miR-132-3p inhibitor 与对照组相当。SNHG5 调控 miR-132-3p 减少CRC细胞的凋亡。5.CREB5在CRC组织和细胞中的差异性表达:统计分析提示CREB5在人类CRC中表达上调。应用qRT-PCR试验及Western blot试验检测结肠癌组织与癌旁组织中CREB5的水平,均支持上述结论。6.MiR-132-3p 和 CREB5 间的关系:miR-132-3p mimics 可以抑制转染CREB5-wt的细胞的荧光素酶活性,而对转染CREB5-mut的细胞荧光活性则没有上述变化,提示miR-132-3p可以直接结合CREB5的3’非编码区域而抑制其表达。在LoVo细胞系中,应用qRT-PCR和Western blot实验,测定CREB5在转染后对应的mRNA和蛋白水平,均显示MiR-132-3p与CREB5的表达呈负相关。得出以下结论:在CRC细胞中,CREB5是miR-132-3p的下游作用靶点。7.MiR-132-3p通过调控CREB5对CRC细胞增殖、转移、迁徙及凋亡的影响:CCK-8试验、Transwell migration实验和Wound healing实验均表明转染CREB5促进LoVo细胞的增殖能力,转染si-CREB5抑制增殖能力,CREB5+miR-132-3p mimics组CRC细胞增殖能力与对照组相当。流式细胞术检测CRC细胞凋亡率则显示si-CREB5组显著升高。以上结果阐明miR-132-3p通过靶向调控CREB5抑制CRC细胞增殖、转移、迁徙,并促进CRC细胞的凋亡。8.体内实验证实lncRNA SNHG5对CRC生长的促进作用:si-SNHG5组裸鼠皮下肿瘤显著小于对照组;Western blot法:si-SNHG5组显著抑制CREB5的表达。综上体内试验显示SNHG5通过调控CREB5影响CRC的增殖能力。9.LncRNA SNHG5及miR-132-3p对CRC细胞中CREB蛋白家族的作用:Western blot提示:与对照组比较,si-SNHG5组中CREB1和CREB3蛋白表达下降;应用miR-132-3p抑制剂miR-132-3p增强后,CREB1和CREB3蛋白的变化趋势与CREB5相似。结论1.LncRNA SNHG5在CRC中表达水平上调。2.LncRNA SNHG5通过单向调控下游靶点miR-132-3p促进CRC细胞的增殖、转移和迁徙、抑制CRC细胞的凋亡。3.MiR-132-3p在CRC组织及细胞中的表达下降,CREB5在CRC组织及细胞中的表达上调。4.MiR-132-3p通过调控下游靶点CREB5抑制CRC细胞增殖、转移、迁徙,促进CRC细胞的凋亡。