【摘 要】
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布鲁氏菌是革兰氏阴性的兼性胞内细菌。它能够使多种动物和人感染,并使宿主患上布鲁氏菌病,严重危害畜牧业健康发展和人类身体健康。现有疫苗的缺陷等多种因素致使该病的净化困难重重,人类的慢性感染难以彻底治愈。深入揭示布鲁氏菌的致病机制是研发新的布病防控制剂的关键。转录调控因子c AMP受体蛋白（c AMP receptor protein,CRP）作为细菌调控因子,在调控碳源代谢、群体感应系统、细菌毒力和
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31672584）；
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布鲁氏菌是革兰氏阴性的兼性胞内细菌。它能够使多种动物和人感染,并使宿主患上布鲁氏菌病,严重危害畜牧业健康发展和人类身体健康。现有疫苗的缺陷等多种因素致使该病的净化困难重重,人类的慢性感染难以彻底治愈。深入揭示布鲁氏菌的致病机制是研发新的布病防控制剂的关键。转录调控因子c AMP受体蛋白（c AMP receptor protein,CRP）作为细菌调控因子,在调控碳源代谢、群体感应系统、细菌毒力和生物被膜形成方面发挥重要作用。该家族在布鲁氏菌中共有6个家族成员,其中,转录调控因子nnr R是B.suis S2菌株中转录表达水平最高的成员。研究发现,羊种布鲁氏菌c AMP结合蛋白Cbp B参与对布鲁氏菌毒力的调控。进一步研究布鲁氏菌nnr R的功能及其对生物被膜形成的作用,对于全面认识布鲁氏菌毒力因子致病机制的调控网络具有重要意义。本研究构建nnr R原核表达载体,制备小鼠抗Nnr R多克隆抗体。运用同源重组技术结合电转化法,构建布鲁氏菌nnr R基因缺失株（Δnnr R）和nnr R质粒回补株（cΔnnr R）。进一步检测分析nnr R对布鲁氏菌主要生物学特性及其生物被膜形成的影响。试验结果如下:1.利用PCR技术扩增nnr R基因,构建p ET28a-nnr R原核表达载体,诱导表达并纯化r Nnr R重组蛋白。免疫小鼠,用ELISA法检测血清抗体效价,制备多克隆抗体。2.以p MD19T作为构建缺失菌株的载体,p BBR1MCS-5作为构建回补菌株的载体,采用同源重组技术,再结合电转化法,经过抗生素和PCR筛选,构建布鲁氏菌nnr R基因缺失株和nnr R质粒回补株,用q PCR和Western Blot等方法鉴定,分别命名为Δnnr R和cΔnnr R。3.通过扫描电镜观察和绘制生长曲线,发现布鲁氏菌nnr R缺失对布鲁氏菌正常培养条件下的生长和形态无显著影响（p＞0.05）。通过检测B.suis S2、Δnnr R和cΔnnr R菌株在酸性、高渗和高温环境下的细菌存活率发现,B.suis S2、Δnnr R和cΔnnr R菌株在酸性条件下的存活率无显著性差异（p＞0.05）;Δnnr R菌株的细菌存活率在高渗环境下显著高于B.suis S2菌株（p＜0.05）;Δnnr R菌株在高温环境下的存活率显著低于B.suis S2和cΔnnr R菌株（p＜0.05）。应用B.suis S2、Δnnr R和cΔnnr R菌株分别感染RAW264.7细胞和BALB/c小鼠,发现B.suis S2、Δnnr R和cΔnnr R菌株在巨噬细胞中的生存和增殖以及在小鼠体内的毒力均无显著性差异（p＞0.05）。4.通过结晶紫染色法检测布鲁氏菌生物被膜形成的变化,利用q PCR法检测布鲁氏菌生物被膜形成相关抑制基因的转录表达水平,发现nnr R缺失显著抑制布鲁氏菌生物被膜的形成（p＜0.05）,上调布鲁氏菌生物被膜形成相关抑制基因的转录表达水平。用EMSA法检测发现,Nnr R蛋白未与生物被膜形成相关抑制基因启动子结合。以上结果表明,转录调控因子Nnr R缺失能够促进布鲁氏菌耐高渗的能力,抑制该菌耐高温和形成生物被膜的能力,但是对布鲁氏菌的生长、形态、耐酸能力、在巨噬细胞中的生存和增殖以及在小鼠体内的毒力均无显著影响。进一步研究发现,缺失nnr R使布鲁氏菌生物被膜形成相关抑制基因Dna J,EF-Tu,Tet B,gro ES,acc A,fab I-1,ilv C,Exs B,Cys G,rbs B-1和Cys I的转录表达水平上调。提示布鲁氏菌nnr R通过影响上述基因的表达促进布鲁氏菌生物被膜的形成。为揭示布鲁氏菌转录调控因子Nnr R对主要生物学特性和生物被膜形成的调控研究奠定基础。
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