拟南芥中HY5-MIR858-MYBL2调控途对花青素合成的影响研究

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光是控制植物生长发育的重要环境因子之一,在植物生长进程中起关键作用。植物调整自身的生理平衡以适应光信号因子的波动。光信号作为一种信息流输入植物体内,经过复杂的加工处理过程,以不同的形式输出,花青素就是一类典型的信息输出流,它是植物响应光信号的一类次级代谢产物,它的合成依赖于光因子信息流。因此,揭示花青素合成的复杂调控模式一方面可以帮助我们清楚地认识生物学现象的本质,另一方面为花青素相关农产品的遗传改良提供分子依据。目前,关于光信号通路的研究很广泛且深入,有扎实的理论基础,但是,光信号诱导的花青素合成及其调控模式报道的不多,microRNA参与调控花青素的的报道也寥寥无几。本研究以光信号诱导和miR858参与的花青素合成途径为研究目的,利用生物信息学、遗传学和分子生物学手段,以模式植物拟南芥为研究对象,探究出了一条重要的分子调控机制,开展了以下几方面的研究:(1)在不同光照条件下培养野生型和hy5突变体的拟南芥幼苗,发现HY5会促进拟南芥对光照强度的响应,诱导花青素的积累;(2)运用RT-qPCR分析实验发现HY5会抑制花青素合成抑制基因MYBL2基因的表达,利用转基因技术获得proMYBL2:GUS/WT阳性苗,同时,通过遗传杂交的方法得到proMYBL2:GUS/hy5苗,GUS染色实验结果表明,在hy5突变体背景下的GUS信号比野生型背景下的GUS信号强,即HY5可以在转录水平负调控MYBL2的表达;(3)通过染色质免疫共沉淀(ChIP)实验,发现HY5可以结合到MIR858启动子的两个G-box上,利用RT-qPCR实验我们发现,野生型中miR858的表达量高于hy5突变体,说明HY5的结合会促进MIR858的转录,进一步用GUS实验发现,在hy5背景下或者MIR858基因的启动子上G-box缺失的情况下,GUS报告基因均表现为较弱的信号,表明HY5对MIR858的正调控作用;(4)利用转基因技术获得miR858的过表达和沉默植株后,检测两者中miR858的含量发现,过表达材料有明显的上调,而在沉默材料中有明显的下调,经过花青素表型的观察确定miR858会增加花青素的积累,进一步用RT-qPCR的方法发现,LDOX和DFR在过表达上调,说明miR858在花青素代谢过程中起到正调控因子的作用;(5)通过生物信息学分析,发现miR858可以靶向MYBL2,利用5’RACE技术分析,我们验证了 miR858不能剪切MYBL2的mRNA,RT-qPCR实验的结果显示在过表达和沉默的材料中MYBL2的表达量也未发生改变,说明miR858不能影响MYBL2基因的转录水平;(6)利用遗传杂交手段将GFP-MYBL2融合蛋白的转基因材料分别杂交到miR858过表达和沉默的材料中,通过观察GFP荧光值来反映MYBL2的蛋白水平,结果显示在miR858改变的情况下,GFP的荧光会受到影响。运用REN-LUC双荧光素酶基因报告系统实验,以REN-MYBL2-LUC载体作为报告系统,以miR858过表达载体作为效应系统,共转化到烟草原生质体中,结果显示miR858会影响融合蛋白MYBL2-LUC的化学发光;(7)通过遗传杂交手段构建遗传材料、花青素表型观察和定量分析等方法,我们确定了HY5-miR858-MYBL2在花青素通路中的上下游关系;综上所述,我们首次发现了HY5-miR858-MYBL2调控环可以参与到光信号诱导的花青素积累的生物途径中,并阐明了这三个基因之间的调控关系,在光照和黑暗条件下,HY5与MYBL2组成了“跷跷板”模型来控制花青素合成的开启和关闭,丰富了花青素代谢的调控网络,为我们理解光信号通路提供了另一条线索,为农业生产的优化奠定了基础。
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