高效毛细管电泳(HPCE)技术,相对于大家熟知的高效液相、气相色谱而言,是一种新的分离技术,它能够分离各种分子量的物质,甚至包括大分子蛋白质。分离前,将毛细管末端浸入样品瓶,在外加气压力、真空或电压作用下样品进入管内,然后待测物在高电场作用下根据其电荷量、分子大小和疏水性被分离开。依据选用毛细管类型和电解质缓冲液的不同电泳可分为几种分离模式,其中最简单的一种分离模式就是毛细管区带电泳(CZE)。毛细管区带电泳的本质特点是整个毛细管内充盈的电泳缓冲液为均质且电场强度相同,待测物根据荷质比不同而被分离。 氨甲蝶呤(MTX)是本实验的主要研究对象,它作为抗叶酸代谢药物的代表在临床广泛应用,自然界中存在L型和D型两种对映体形式。本论文报道用高效毛细管电泳技术建立氨甲蝶呤定量和其手性对映体拆分方案,并以此为平台对这两种对映体抗肿瘤效应进行研究。实验供分为三部分。 第一部分 血清中氨甲蝶呤定量检测方法建立及应用 首先,在实验中综合考虑了缓冲液、pH值和毛细管温度温度和样品处理等多种影响分离的因素,最终在方案中选用直径75μM,总长60cm,有效长度50.5cm未包被的石英毛细管,以pH7.3,浓度75mM的磷酸盐为电泳缓冲液,检测波长为306nm,在25kv电压下,结果MTX的出峰时间在10分钟内。实验中对该方案进行了评价:本方案的线性范围为1.1μmol/L-1100.0μmol/L,最低检出浓度为0.55μmol/L,在22—110μmol/L范围内的回收率为88.2%—98.2%,批间精密度为5.4%,批内精密度为4.2%。本方法特点:快速,准确且低成本,它不仅适用科研工作MTX浓度的检测,还能为临床MTX血药浓度监测提供了一种有效的手段。 第二部分 氨甲蝶呤对映体拆分方法建立及应用 由于对映体所具有的物理和化学性质相同,所以具有非对称手性碳的对映体药物的分离是一件有挑战意义的工作。对映体必须在手性环境才能被分离,毛细管电泳技术由于能将溶液中的手性试剂可以通过用简单的加压方法导入毛细管