支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早产儿的重要并发症和婴幼儿时期常见的慢性呼吸系统疾病,其确切致病因素及致病机理尚未完全明了,长期使用高浓度氧导致肺损伤是其主要致病因素之一,国内外研究认为肺发育停滞是其主要的病理改变。近年来有研究认为肺发育调控因子时空上的表达异常均会影响正常肺形态发育。转化生长因子β1(Transforming growth factor beta-1,TGF-β1)是转化生长因子家族的主要成员之一,在正常的肺形态发生、组织塑形和重塑中起着重要作用,目前认为吸入高浓度氧导致TGF-β1表达异常在肺发育停滞中意义重大。研究吸入高浓度氧导致肺损伤的的相关机制及通过干预改善肺发育障碍足防治支气管肺发育不良的一个新的策略和方向。 目的： 1.探讨TGFβ-1在高氧诱导肺损伤导致支气管肺发育不良新生SD大鼠模型肺组织中的表达特点,及与支气管肺发育不良的关系,为支气管肺发育不良的机制研究提供事实和实验依据； 2.使用RNAi技术沉默TGF-β1基因表达,观察TGF-β1表达水平与肺损伤的关系,进一步揭示BPD发生的病理机制,为找到早期干预的新途径和基因干预治疗提供依据。 方法： 1.以新生3d SD大鼠为研究对象,浓度≥95％的高氧暴露7d,建立高氧肺损伤、BPD的动物模型。 2.将新生鼠随机分为正常对照组、模型未干预组、TGF-βlsiRNA干预组、生理盐水组,TGF-βlsiRNA干预组通过气管给药途径将构建好的TGF-βlsiRNA腺病毒载体转染至体内,生理盐水组以等容量NS代替TGF-βlsiRNA腺病毒载体经气管内注入。 3.利用光学显微镜观察各组新生鼠肺组织形态学变化,应用图像处理分析软件系统,测量肺泡数目、直径、肺泡面积及肺泡间隔厚度,对各组新生鼠肺组织病理学形态改变做定量分析,比较TGF-βlsiRNA干预前后肺组织形态学表现。 4.采用实时荧光定量PCR方法检测各组新生鼠肺组织中TGF-β1 mRNA水平的表达变化,结合肺组织形态学变化,评价TGF-βlsiRNA的干预效果。 5.采用免疫组化方法检测各组新生鼠肿组织中TGF-β1蛋白水平的表达变化,结合肺组织形态学变化,评价TGF-βlsiRNA的干预效果。 结果： 1.新生SD大鼠肺损伤、BPD模型的构建：新生3d SD大鼠持续≥95％的高氧暴露7d,表现为活动减少,反应迟钝,体重和身长均增长缓慢,模型未干预组、NS组体重与正常对照组比较,差异具有统计学意义(t=6.872,P<0.01;t=6.313,P<0.01),其身长与正常对照组比较,差异无统计学意义(t=1.595,P>0.05;t=2.005,P>0.05)。 2.气管给药途径的建立:TGF-βlsiRNA腺病毒载体经气管内注入后,荧光显微镜观察有绿色荧光表达,证实已成功转染至肺内。 3.光学显微镜观察各组新生鼠肺组织形态学变化显示：低倍光镜观察正常新生鼠肺泡结构清楚、大小均一,无液体和炎性渗出；模型未干预组、NS组新生鼠可见肺泡壁较薄、结构简单化,肺泡数目明显减少,肺泡大小不均,有些肺泡融合,肺泡面积减小；TGF-βlsiRNA干预组肺泡壁较模型未干预组、NS组增厚,肺泡数目增多,肺泡形状不规则,肺泡面积增大。高倍镜观察,正常对照组肺泡壁完整,肺泡内少见脱落细胞；模型未干预组、NS组新生鼠肺泡中可见少许红细胞和巨噬细胞渗出,并可见脱落的肺上皮细胞；TGF-βlsiRNA干预组部分肺间隔明显增厚,间质内细胞增多。模型未干预组、NS组与正常对照组比较肺泡数目减少,直径变大,肺泡面积减小,肺泡间隔厚度减小,差异具有统计学意义(P<0.01);TGF-β lsiRNA干预组与模型未干预组、NS组比较,肺泡数目增多,直径变小,肺泡面积增大,肺泡间隔厚度增加,差异具有统计学意义(P＜0.01)。 4.实时荧光定量PCR检测TGF-β 1mRNA的表达：正常对照组TGF-β 1mRNA相对表达量为1.00±0.24,模型未干预组和NS组TGF-β 1mRNA相对表达量分别为1.85±0.54、2.42±0.40,较正常组明显增强,差异具有统计学意义(t=4.099,P＜0.01：t=8.631,P＜0.01)。TGF-β lsiRNA干预后肺纽织中TGF-β 1mRNA相对表达量为0.76±0.34,较模型未干预组和NS组TGF-β 1mRNA表达分别下调了58.91％、68.61％,差异具有统计学意义(t=4.831,P＜0.01;t=8.890,P＜0.01)。 5.免疫组织化学检测:TGF-β1免疫组化阳性细胞主要分布在肺间隔,较厚的肺泡壁也有散在分布；正常对照组阳性表达较少,散在分布,偶见靠近支气管部位的集中显色；模型未干预组、NS组阳性细胞明显增多,可见明显集聚；其中模型未干预组、NS组阳性百分比(％)分别为5.78±0.63、5.49±0.53,均高于正常对照组3.27±0.68,差异具有统计学意义(t=7.689,P＜0.01;t=7.317,P＜0.01)：TGF-β lsiRNA干预组阳性百分比(％)为3.59±0.48,阳性细胞较模型未干预组、NS组表达明显减少,差异具有统计学意义(t=7.835,P＜0.01;t=7.531,P＜0.01)。 结论： 1.通过持续吸入高浓度氧气可以诱导肺损伤构建BPD模型,高氧肺损伤时肺组织中TGF-β 1mRNA、蛋白表达明显增加。 2.高氧诱导新生鼠肺损伤时TGF-β 1mRNA、蛋白表达明显增加,通过气管注入TGF-β1siRNA腺病毒载体能成功转染并能有效下调TGF-β 1mRNA、蛋白的表达,而减轻高氧肺损伤的肺部病理改变,提示TGF-β1可能通过阻碍肺发育参与BPD模型鼠高氧肺损伤的发生。 3.TGF-β 1siRNA腺病毒载体能有效沉默高氧诱导新生鼠肺损伤时肺组织中TGF-β1mRNA表达,提示TGF-β1siRNA腺病毒载体是沉默TGF-β1的有效工具,为BPD的早期干预奠定实验基础,为基因干预治疗提供事实和实验依据。