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淋巴细胞膜上钾通道Kv1.3已经成为治疗众多自身免疫性疾病（如多发性硬化症、类风湿性关节炎及银屑病）的药物靶标。长期以来,化学小分子候选药物因为作用钾通道Kv1.3选择性低和潜在毒副作用大等不足而难以进入临床试验。分子内具有3对以上二硫键多肽因具有更高的选择性,尤其是来自海葵毒素多肽Sh K-186完成了临床I期试验,这标志着作用钾通道Kv1.3免疫抑制多肽药物研发成为了新方向。在本论文中,我们基于课题组长期从事蝎毒素多肽与钾离子通道相互作用与应用研究的工作基础,开展了作用钾通道Kv1.3免疫抑制多肽的筛选与设计研究。首先本论文开展了作用钾通道Kv1.3免疫抑制多肽药物的筛选研究。基于我们课题组前期工作积累,本论文侧重筛选具有新型结构特征的免疫抑制多肽:Kunitz-type蛋白酶抑制剂多肽和防御素多肽。试验发现了Kunitz-type多肽Hg1的C端截短肽H2是一种新的Kv1.3通道抑制多肽,半数抑制浓度为8.5 n M。功能检测发现人防御素多肽h BD4在1μM浓度下对Kv1.1,Kv1.2,SKCa3及IKCa通道没有明显活性,但它对Kv1.3通道具有较弱的活性,1μM h BD4可以抑制34.0±0.2%的Kv1.3通道电流。试验中的真菌防御素Micasin多肽以较弱的活性作用Kv1.3通道,1μM真菌防御素Micasin多肽可以抑制34.7±3.5%的Kv1.3通道电流。这些工作表明了作用钾通道Kv1.3的多肽筛选策略的成功需要增加多肽筛选规模和提高实验成本,同时具有不可预知的风险性。因分子内具有多对二硫键的多肽制备成本高,运用新策略研发作用钾通道Kv1.3免疫抑制多肽药物成为本论文的一个重要工作。其次,本论文应用多肽分子内酸性氨基酸残基对键合界面的调控功能,开展了作用钾通道Kv1.3免疫抑制多肽药物的设计研究。基于我们课题组先前提出通过调节多肽酸性氨基酸残基分布改造作用钾通道多肽键合模式的新技术,我们发现了具有特定键合模式的蝎毒素Bm KTX能够通过同时作用钾通道孔区的Turret和过滤器区域的氨基酸残基具有良好选择性,而具有经典键合模式的蝎毒素Bm KTX-D33H主要通过作用钾通道孔区的Turret区域具有相对较差的选择性。为了获得高选择性和高活性免疫抑制多肽,本论文以具有特定键合模式的蝎毒多肽Bm KTX为模板进行改造及优化。通过改造蝎毒素多肽Bm KTX的酸性氨基酸分布,以维持与蝎毒素多肽Bm KTX相似的键合模式,设计了一系列Bm KTX衍生多肽。电生理学实验表明,4个Bm KTX类似物（AIDP-5,AIDP-6,AIDP-8和AIDP-12）对h Kv1.3通道,具有很好的抑制活性,半数抑制浓度分别为5.4±1.7n M,0.8±0.1 n M,5.9±2.1 n M和3.1±2.4 n M。因此,我们选择了比野生型肽Bm KTX(IC50值是5.0±1.5 n M)活性更高的3个Bm KTX-like多肽（AIDP-5,AIDP-6和AIDP-12）,以进一步开展它们的药理学研究。通道选择性试验表明了AIDP-6是一个高选择性多肽,它作用钾通道h Kv1.1,h Kv1.2,h Kv1.6等通道的半数抑制浓度分别为408.0±74.9 n M,184.5±75.0 n M及1489.3±102.5 n M,1μM浓度AIDP-6对h Kv1.5,h Kv3.2,h ERG,KCNQ1以及h Kv4.1-4.3通道都没有明显的抑制活性。细胞功能实验表明AIDP-6在体外实验中有效地抑制Jurkat细胞的IL-2细胞因子的分泌。动物实验表明它还可以显著地改善大鼠的迟发型超敏反应（DTH）,这是一种自身反应性T细胞介导的炎症模型。可见,这些工作表明了利用具有特定键合模式蝎毒素Bm KTX或类似多肽为模板,通过优化多肽中酸性氨基酸残基空间位置,为作用钾通道Kv1.3选择性多肽药物的研发带来新希望。再次,本论文对高选择性多肽AIDP-6开展了结构优化研究。基于Bm KTX相似序列多肽的序列比对和结构分析,推测Bm KTX中的Asp33残基的替换可能影响作用Kv1.3通道多肽的选择性。为了提高AIDP-6的选择性,我们对Lys33分别进行了优化研究,构建了一系列的AIDP-6衍生多肽（AIDP-6-K33A,AIDP-6-K33H,AIDP-6-K33R,AIDP-6-K33T及AIDP-6-K33Y）。电生理实验结果显示Bm KTX-K6D的五个新构建的衍生肽（AIDP-6-K33A,AIDP-6-K33H,AIDP-6-K33R,AIDP-6-K33T及AIDP-6-K33Y）对h Kv1.3通道都具有高效的抑制活性,半数抑制浓度分别为:1.0±0.1 n M,0.5±0.1 n M,0.7±0.2 n M,6.5±0.8 n M及4.5±1.1n M。与野生型多肽AIDP-6相比,33位置氨基酸的改变并没有显著影响多肽的Kv1.3通道的抑制活性,但是改善了它对h Kv1.3通道的选择性。试验发现AIDP-6-K33H对h Kv1.2,h Kv1.6通道的半数抑制浓度分别为322.2±50.8 n M和1217.2±90.3 n M。1μM AIDP-6-K33H可以抑制54.1±1.8%的h Kv1.1通道电流,且对h Kv1.5,h Kv3.2,h ERG,KCNQ1以及h Kv4.1-4.3通道都没有明显的抑制活性。与AIDP-6的药理学性质相比,ADIP-6-K33H具有更高的选择性。这些工作表明了在不改变AIDP-6的键合模式情况下,通过优化多肽键合界机的功能氨基酸残基,可以进一步提高多肽的活性和选择性,它为提高Bm KTX-like免疫抑制多肽的活性和选择性研究提供了新思路。最后,本论文应用多肽分子内酸性氨基酸残基对键合界面的调控功能,开展了作用钾通道Kv1.3多肽Bm KTX键合界面的精细调控研究。以与多肽Bm KTX序列高度相似的多肽AIDP-6为模板,通过微小改变酸性氨基酸的位置构建了一系列的衍生多肽,以确定酸性氨基酸的更全面的调控作用。通过酸性氨基酸扫描,我们构建了14个Bm KTX-like多肽,其中酸性氨基酸的位置在多肽的空间的各个区域都有分布。电生理实验结果显示大多数Bm KTX-like多肽对Kv1.3通道具有高效的抑制活性,半数抑制浓度在5 n M左右。为了研究这些衍生多肽与Kv1.3通道的作用界面,我们选择多肽中的两个关键的碱性氨基酸Arg23和Lys26作为指标,利用定点突变技术对这两个位置氨基酸进行丙氨酸替换,确定这两个氨基酸在上述衍生多肽中功能的变化。实验结果显示这两个氨基酸的作用随着酸性氨基酸的位置变化而变化,表明酸性氨基酸在多肽与钾通道的相互作用中起到关键作用。通过调控酸性氨基酸的分布,我们成功获得一系列对Kv1.3通道具有高效的抑制活性多肽,为发现高选择性多肽带来新的希望。综上所述,本论文开展了作用Kv1.3通道免疫抑制多肽的筛选与设计研究,在多肽药物筛选面临“不确定性”的情况下,本论文主要采用了多肽酸性氨基酸对键合界面调控的独特角色,获得了高活性和高选择性多肽AIDP-6。在些基础了,通过优化其键合界面的功能氨基酸残基,进一步提高了AIDP-6的活性和选择性。这些工作进一步地推动了Kv1.3通道免疫多肽的设计及开发,也为未来作用Kv1.3通道特异性多肽药物的研发提供了新的理论及技术基础。