背景和目的：　　软骨内成骨不仅是脊椎动物长骨发育的基本过程，也是成人骨修复的基本骨形成途径。利用软骨内成骨的方式构建组织工程骨在修复大段骨缺损方面具有优势，因为软骨内成骨过程中首先形成软骨雏形，而后对软骨基质进行重塑产生新骨。利用这种方式构建的组织工程骨不受限于传统组织工程骨需要早期血管化的要求。因此此种方法可以用于产生更大的移植物以修复大段骨缺损。在构建基于软骨内成骨方式的骨修复体系时，首先将种子细胞进行软骨分化和肥大化分化诱导，然后种植于骨缺损处进行骨修复。影响基于软骨内成骨方式的骨修复效果的因素有两个，一个是宿主有害微环境对移植物中肥大软骨细胞的活性的损伤，另一个是肥大软骨细胞中软骨内成骨关键基因的表达。　　一方面，当植入物植入大段骨缺损处后，暂时的缺氧坏境会损害细胞的氧化还原平衡，导致植入细胞活力降低。这也对肥大软骨细胞功能的发挥产生影响。因此在构建基于软骨内成骨的组织工程骨时，我们试图引入一种具有抗氧化作用的药物可以对抗缺氧环境对于植入物中细胞的损伤。　　另一方面，肥大软骨细胞中软骨重塑关键基因的表达影响软骨内成骨进程。软骨内成骨是软骨组织逐渐被骨替代的过程。在这种替代过程中的核心事件是软骨基质的重塑。这种重塑依赖于软骨基质降解和软骨基质内血管生成。在软骨基质重塑的过程中，由肥大软骨细胞表达的Mmp13和Vegfα发挥了关键作用。Mmp13对软骨基质内的胶原进行降解，使软骨基质松散，血管容易侵入。同时，肥大软骨细胞的分化进入终末后，血管生成生长因子Vegfα开始表达，促进血管侵入软骨，血管的侵入带来了成骨和破骨细胞前体，两者的相互作用使新骨形成。　　因此，对肥大软骨细胞中软骨基质关键基因调控的系统研究，为增强基于软骨内成骨方式的骨修复效果提供了新思路。　　长链非编码RNA(long non coding RNA, lncRNA)对基因表达的调控作用是最近研究的热点。已经发现 lncRNA 在生物发育和基因表达中发挥复杂和精确的调节功能。最近的研究表明，lncRNA 在间充质干细胞增殖，软骨细胞分化和骨关节炎发展中起着重要的调节作用。本课题组的研究表明[1] 在间充质干细胞软骨和肥大分化过程中存在大量差异表达的lncRNAs。使用siRNA敲除lncRNA后，与软骨和肥大相关的标记基因发生显着变化，表明 lncRNA 参与软骨细胞的肥大分化。但是，他们的具体生物学机制和靶基因还没有被研究。　　本研究的目的是：　　(1)建立基于软骨内成骨方式的骨修复体系，并探讨利用抗氧化药物芒果苷干预肥大软骨细胞后，对最终骨修复效果的影响。　　(2)研究软骨肥大化阶段表达升高的lncRNA对软骨内成骨关键基因的调控作用和初步机制探讨。　　材料与方法：　　(1)体内和体外基于软骨内成骨方式的骨修复效果评价体系的建立及药物芒果苷干预后对该体系成骨效果的影响。采用骨髓间充质干细胞微球培养的方式，在体外软骨诱导2周，然后软骨肥大化诱导2周，构建体外软骨内成骨体系，利用Realtime-qPCR、Western blot和免疫组化等技术进行评价。利用Balb/c小鼠构建股骨缺损模型，构建基于软骨内成骨方式的原位骨修复模型。利用上述体内外体系，探讨在芒果苷干预软骨细胞肥大分化关键基因表达后，对基于软骨内成骨方式的骨修复体系成骨效果的影响。　　(2)对在软骨细胞肥大分化中高表达的lncRNAs进行筛选和验证。对选出的lncRNA，采用生物信息学方法对其基本性质进行预测和分析。利用lncRNA过表达和沉默的方法，研究该lncRNA对软骨内成骨中关键基因的表达的影响。利用RNA荧光原位杂交技术对该 lncRNA 进行细胞内定位。利用双荧光素酶报告基因技术探讨lncRNA对软骨内成骨关键基因表达影响的初步机制。　　结果：　　(1)体内外模型能够模拟软骨内成骨中基因表达的变化。药物芒果苷通过激活肥大软骨细胞自噬促进软骨细胞肥大分化，从而促进基于软骨内成骨的骨修复效果。　　(2)通过lncRNA芯片在软骨细胞肥大分化阶段鉴定出一个高表达的lncRNA—NONMMUT038035，并将其命名为lnc-HCAR，并且通过RNA-FISH观察到其分布在细胞质中。过表达或沉默 lnc-HCAR 表达，软骨细胞肥大化相关转录因子无明显变化。但是，软骨基质重塑关键基因 Vegfa 和 Mmp13 发生显著差异。经过生物信息学分析结果显示，lnc-HCAR 可能与 miR-15b-5p 结合。向肥大软骨细胞内转染miR-15b-5p mimics和 anti miR-15b-5p后Vegfa和Mmp13表达变化有显著差异，表明miR-15b-5p对Vegfa和Mmp13具有负性调节作用。双荧光素酶报告基因分析结果表明，lncRNA竞争性结合miR-15b-5p增加Vegfa和Mmp13的表达。　　结论：　　本研究建立了基于软骨内成骨方式的骨修复体系，并初步证明利用药物干预体系内软骨细胞肥大化分化可以对该骨修复体系的修复效果进行调控。同时，长链非编码RNA作为新颖的基因调控手段，能够调控软骨内成骨过程中关键基因Vegfa和Mmp13的表达。lnc-HCAR作为miR-15b-5p分子海绵，能够促进Vegfa和Mmp13的表达提示其在软骨内骨骨修复中发挥作用。进一步的体内修复实验需要进行，以明确lnc-HCAR在原位骨修复过程中，对Vegfa和Mmp13调控的作用及对基于软骨内成骨方式的骨修复体系的修复效果的影响。