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目的制备猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）CV777株刺突蛋白（PEDV-S）的多克隆抗体,进一步探究PEDV-S蛋白的结构和功能。筛选PEDV-S1蛋白与Vero细胞膜的互作蛋白,对PEDV感染Vero细胞的可能相关受体进行初步探究,为深入研究PEDV的致病机制和相关受体奠定基础。方法1.原核表达重组质粒p ET-30a（+）-S、p Nus32T-S1及真核表达重组质粒p FLAG-CMV-3-S1a的构建:将扩增的目的片段分别连接至p ET-30a（+）、p Nus32T、p FLAG-CMV-3载体上构建原核表达重组质粒p ET-30a（+）-S、p Nus32T-S1及真核表达重组质粒p FLAG-CMV-3-S1a。将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中克隆并提取质粒,进行双酶切及测序验证。2.PEDV-S及PEDV-S1融合蛋白的原核诱导表达及纯化:双酶切验证及测序正确后将重组质粒p ET-30a（+）-S、p Nus32T-S1分别转化至大肠杆菌BL21中,优化诱导条件原核表达PEDV-S及PEDV-S1融合蛋白。通过包涵体变性、复性、透析、超滤等方法纯化PEDV-S融合蛋白,Ni离子亲和层析柱法纯化PEDV-S1融合蛋白。通过蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测PEDV-S融合蛋白,BCA法测定PEDV-S融合蛋白的浓度。3.PEDV-S蛋白多克隆抗体制备及特性检测:用纯化后的PEDV-S蛋白为抗原免疫8周龄C57BL小鼠,免疫前采取血样作为对照。初次免疫1:1混合PEDV-S蛋白与弗氏完全佐剂,完全乳化后皮下多点注射100μg/次。两周后换为不完全佐剂再次免疫小鼠,与初次免疫方式相同。此后每隔两周加强免疫一次,共免疫4次。通过Western blotting及ELISA方法测定多克隆抗体的特异性、灵敏度及其效价。4.多克隆抗体的应用:对CV777病毒感染的Vero细胞进行间接免疫荧光法（IFA）检测及Western blotting检测,验证病毒感染后其蛋白的表达情况;对p FLAG-CMV-3-S1a质粒转染293T细胞后表达的PEDV-S1a蛋白及原核表达纯化的PEDV-S1融合蛋白进行IFA及Western Blotting检测,验证该多克隆抗体对表达蛋白的识别情况。5.PEDV-S1蛋白在Vero细胞上可能相关受体的初步筛选:使用invent蛋白提取试剂盒提取Vero细胞的质膜蛋白,BCA法测定膜蛋白的浓度。将PEDV-S1蛋白与Vero细胞质膜蛋白进行Pull Down反应,同时设置未加Vero细胞质膜蛋白的对照组,银染显色比较差异条带,验证蛋白互作。将Pull Down后的蛋白样品进行质谱鉴定,探究PEDV-S1蛋白与Vero细胞膜蛋白的互作蛋白。结果1.原核表达重组质粒p ET-30a（+）-PEDV-S、p Nus32T-PEDV-S1及真核表达重组质粒p FLAG-PEDV-S1a的构建:经双酶切验证和测序鉴定,成功构建了原核表达重组质粒p ET-30a（+）-PEDV-S、p Nus32T-PEDV-S1及真核表达重组质粒p FLAG-PEDV-S1a。2.PEDV-S及PEDV-S1融合蛋白的原核诱导表达及纯化:PEDV-S融合蛋白在IPTG为0.5m M时,16℃诱导8h表达量较多,且主要为包涵体表达,经变性、复性、透析、超滤等方法获得浓度为1mg/m L的融合蛋白。PEDV-S1融合蛋白在IPTG为0.5m M时,37℃诱导2h有明显的可溶性表达蛋白,15℃诱导15h可溶性表达量增多,经Ni离子亲和层析柱法纯化目的蛋白。3.PEDV-S融合蛋白多克隆抗体制备及特性检测:用PEDV-S融合蛋白免疫8周龄C57BL小鼠,制备多克隆抗体。经Western blotting及ELISA测定多克隆抗体的特异性、灵敏度及其效价。成功制备出效价大于1:3280500,可检测出5ng目的蛋白的多克隆抗体。4.多克隆抗体的应用:使用制备的多克隆抗体对CV777病毒感染的Vero细胞进行IFA检测,病毒感染后表达的蛋白位于细胞膜上,Western blotting检测到S蛋白及S1蛋白的表达。对真核表达质粒转染293T细胞后表达的PEDV-S1a蛋白及原核表达纯化的PEDV-S1融合蛋白分别进行IFA及Western Blotting检测,该多克隆抗体可识别真核表达的PEDV-S1a蛋白及原核表达的PEDV-S1蛋白。5.PEDV-S1蛋白在Vero细胞上可能相关受体的初步筛选:使用invent蛋白提取试剂盒提取Vero细胞的质膜蛋白,BCA法测定蛋白的浓度为0.6mg/m L。将PEDV-S1蛋白与Vero细胞质膜蛋白进行Pull Down实验,同时设置未加Vero细胞膜蛋白的对照组,银染后与对照组相比出现差异条带,证明出现互作蛋白。将Pull Down后的蛋白样品进行质谱鉴定,鉴定结果显示与PEDV-S1蛋白互作的蛋白共有55种,其中有9种蛋白位于Vero细胞膜上,与PEDV-S1蛋白互作,有可能作为病毒感染细胞的潜在受体。结论1.成功构建了原核表达重组质粒p ET-30a（+）-PEDV-S、p Nus32T-PEDV-S1及真核表达重组质粒p FLAG-PEDV-S1a。2.成功纯化出PEDV-S融合蛋白及PEDV-S1融合蛋白。3.成功制备出高灵敏度、高效价的PEDV-S蛋白的多克隆抗体。4.蛋白质组学分析初步筛选得到钠/钾运输ATP酶α亚基、GRP75、GRP78、60k Da伴侣蛋白、细胞分裂控制蛋白42同源物、ATP合酶α亚基、ATP合酶β亚基、Prohibitin、Annexin 9种与PEDV-S1蛋白互作的Vero细胞膜蛋白,可能作为PEDV感染细胞的潜在受体。