间隙连接(gap junctions，GJ)是相临细胞间进行离子和小分子流通与信息交换的直捷通道，在细胞增殖和分化中起重要作用。大部分肿瘤细胞间隙连接通讯(gap junctional intercellular communication，GJIC)减弱甚至完全消失，且与肿瘤的恶性化程度相关，但是当这些细胞转染了编码间隙连接蛋白connexin(Cx)的基因以后，GJIC功能得以恢复。Connexin 43(Cx43)是Cx蛋白家族最主要的成员之一，它存在于大多数组织细胞中，其磷酸化状态直接影响GJIC的功能。有报道表明一些植物性雌激素能抑制细胞GJIC功能，并引起Cx的磷酸化状态的改变。 [目的] 利用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)的荧光漂白后恢复(fluorescence redistribution after photobleaching，FRAP)技术，观察植物/真菌性雌激素槲皮素(quercetin，QC)、肠内脂(enterolactone，ENL)、拟雌内醇(coumestrol，COM)、染料木黄酮(genistein，GEN)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEL)对HaCaT细胞GJIC的作用，并通过免疫印迹法观察最具代表性的植物性雌激素之一—染料木黄酮对NIH3T3细胞Cx43蛋白磷酸化的影响。 [方法] 1．植物性雌激素和/或TPA对GJIC的影响 HaCaT细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中，在37℃、5％CO。的培养箱中培养传代。细胞接种于直径为 35 mm培养M中，种植密度为ZX10勺XI，随后将培养M移入37C、50COZ的培养箱中培养2天。细胞培养结束前 24小时换液，并加入不同浓度的受试物＊．l、l、10、100 VM人继续培养24小时后用LSCM进行观察。以空白作正常对照，阳性对照组在培养结束前1刁时加入 5 ＂g／thl的 TPA。 GJIC功能测定时，加入终浓度为 10 pg／inl的 5，6－羟基荧光素乙酸乙酚盐 （5，6－carboxyfluorescein diacetate，5，6－CFDA），在 37℃、5％ CO。的培养箱中培养约 15 min，洗掉细胞外多余的 5，6（FDA后，细胞用 Hanks液负载，置于激光扫描共聚焦显微镜上，按照 Zeiss LSM sic release 2刀 1中 FKAP分析程序，在显微镜h20倍物镜）下随机定义感兴趣区域kegions of interest，ROI入 选择其中的细胞作为淬灭对象，荧光漂自程度为细胞初始荧光强度的30％～50％，由漂白后间隔时间 lmin的各次扫描图像共 11帧，获取被漂白细胞荧光恢复以及相邻的未漂白细胞荧光变化的数据。通过拟合漂白细胞以及相邻未漂白细胞荧光强度差值的时间变化函数，计算荧光恢复率（habX100％，其中Im为淬灭后所恢复的荧光强度，几为淬灭的荧光强度）及细胞间荧光传递速率（厂，min”‘人本实验中漂白后扫描门次，共有 10个数据位点用于函数拟合。数据表经 MicrosoftExcel转换后，导入SPSS 10刀作曲线拟合和 t检验。 （Iu人）l（In。．I。）＝XXp（W） 其中几：相邻未漂白细胞在！时间的荧光强度；几。：1＝0时间相邻未漂白细胞的荧光强度；几：漂白细胞 在1时间的荧光强度：仙：t＝0时间漂白细胞的荧光强度；厂：细胞间荧光传递速率二．免疫印迹 NIH3T3小鼠肺成纤维细胞用含10％胎牛血清的yMI 1640完全培养基培养传代，在 37oC、5％COZ的培养箱中培养。细胞接种于 100 mlQ8 cmZ）培养瓶中，密度为 4xlo勺ml，每瓶 10 ml，培养 4天。细胞培养结束前 24 ’J’时加入受试物（GEN，100 pM人 提取细胞总蛋白，用 Bradford法定量后储存于－70OC。10％SDS－聚丙烯酚胺凝胶电泳，起始电压 100 V，待样品在分离胶顶部浓缩成一直线后，加大电压至150 V，电泳 65 min左右。用 Bio－Rad半干转移仪进行转膜，120 a转移 30 min左右。转移完毕后，NC膜用封闭缓冲液（20 mM Tis·HCI，150 mM NaCI，0．l％ 2Tween20，5％脱脂奶粉，pH 7．5）室温封闭 1小时。加入用封闭液稀释的兔抗Cx43多抗（Zymed co＊ Catalog No．71－0700，l：2 000稀释度）室温摇动温育 1小时，TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗记ymed LaboratoriesIncJ Catalog No．sl＊ 120，l：2 000稀释度），室温摇动温育 1’J’ 时，洗膜。将膜暴露于电化学发光（ECL）检测试剂中作用3～5 min（A液＊液一100：l），弃去ECL，膜吸干水份后用保鲜膜包好，暗室中在X光胶片上曝光3—30 min不等，显影液中显影 5 min，在清水中漂洗后放入定影液中，至胶片透明。【结果IQC在0．1～mpM浓度对GnC无明显影响，反而能桔抗T助引起的GnC抑制，但在 100 pM时能抑制 GJIC功能。其它受试的 4种植物性雌激素均能不同程度地抑制细胞 GJIC的功能，ENL在 0二叫 pM范围内都有显著性抑制，但缺乏明确的剂量－依赖关系；ZEL和 GEN在 0．lpM对 GJIC没有影响，但在 l叫pM都能显著性地抑制GJIC，并呈明确的剂量－依赖关系；COM的抑制作用不是简单的线性关系，在0．lpM就有显著性抑制，但lpM的抑制作用没有统计学显著性，而 10 pM以上能显著性抑制