研究背景自噬是一种进化保守的生物学进程,进程中依赖溶酶体降解细胞内蛋白质和受损的细胞器,以维持细胞代谢和内环境的稳态。自噬大致分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬,巨自噬即通常所说的自噬。自噬是细胞固有的生物学行为。在正常情况下,心肌细胞存在自噬行为。但在压力负荷、缺血和缺氧等刺激下,心肌细胞自噬活性改变。自噬参与多种心血管疾病的发生,影响心脏功能的维持和疾病的预后。正常水平的自噬可以保护细胞免受环境刺激的影响,但自噬过度和自噬不足会导致心血管疾病的发生。心肌肥厚是多种心脏疾病共同的病理过程,早期心肌肥厚是心肌细胞对心脏过度负荷的一种适应性改变,能使得心脏维持正常功能,但长时间负荷过重,可导致心脏顺应性下降、心功能降低,并因心肌耗氧量增加,导致心肌缺血等。研究发现心肌细胞自噬和心肌肥厚之间存在着密切的联系。尽管对心肌细胞自噬和肥厚的研究较多,但具体的作用机制目前尚不明确。长链非编码RNAs（long non-coding RNAs,lnc RNAs）是一类新近发现的细胞内源性的RNA分子,长度超度200个碱基,没有编码蛋白的能力。Lnc RNAs既往被认为是基因的“转录噪声”,不具有生物学功能,但随着新一代高通量测序技术的应用和发展,大量具备丰富生物学功能的lnc RNAs被发现,使得lnc RNAs成为近年研究的热点。研究发现lnc RNAs广泛参与基因表达的调控,在细胞的增殖、分化、凋亡及自噬的发生发展中均发挥至关重要的作用。Lnc RNAs可通过基因印记、染色质重塑、剪接调控、m RNAs降解和翻译调控等多个水平进行基因表达调控,参与病理生理过程的调节。Lnc RNAs的异常表达与多种疾病相关,如肿瘤、神经退行性疾病、代谢性疾病和心血管疾病等。超保守区非编码RNAs（transcribed ultra-conserved noncoding RNAs,T-UCRs）是由超高保守序列转录而来的一类特殊的lnc RNAs,在不同种属间有着高度保守性。在肿瘤发生发展过程中T-UCRs的调控作用已有报道,但在心血管疾病发生发展过程中,T-UCRs的研究仍处于起步阶段。因此进一步研究T-UCRs在心肌细胞自噬和心肌肥厚中的分子作用机制,将丰富扩展自噬及肥厚的调控网络,为心血管疾病的防治药物的研发提供新的方向和依据。研究目的（一）构建经血管紧张素II诱导的心肌细胞自噬和肥厚模型,并筛选差异表达的lnc RNAs/m RNAs,确定目标lnc RNAs（二）确定uc.88对心肌细胞自噬和肥厚的调控作用（三）明确uc.88通过促进心肌细胞自噬抑制心肌肥厚的机制研究研究方法（一）心肌细胞自噬和肥厚过程中lnc RNAs/m RNAs差异表达经胶原酶消化联合差速贴壁法分离培养原代大鼠心肌细胞,分别在12小时、24小时、36小时和48小时,用0.1umol/L的血管紧张素II刺激干预心肌细胞;观察血管紧张素II刺激后心肌细胞表面积、心肌肥厚基因的表达变化,以及心肌细胞的自噬活性,以确定血管紧张素II诱导心肌细胞自噬及心肌肥厚的最佳时间。收集正常培养和血管紧张素II诱导后心肌细胞的RNA。通过lnc RNA芯片筛选心肌细胞自噬和肥厚中差异表达的lnc RNAs和m RNAs。对血管紧张素II诱导的心肌细胞自噬及肥厚中差异表达的lnc RNAs进行染色体定位及分类。对差异表达的m RNAs进行GO分析和pathway分析,以确定这些差异表达的基因可能参与的生物学进程。（二）uc.88在心肌细胞自噬和肥厚中的功能探索经血管紧张素II刺激的原代大鼠心肌细胞,通过q RT-PCR的方法检测uc.233、uc.88和uc.378的表达。在AC16心肌细胞和原代小鼠心肌细胞中,通过q RT-PCR的方法检测uc.88的表达。随后,通过核质分离方法和q RT-PCR方法明确uc.88的亚细胞定位。转染针对uc.88的小干扰RNA抑制原代大鼠心肌细胞中uc.88的表达,通过q RT-PCR测定转染效率,之后用血管紧张素II构建心肌细胞自噬和肥厚模型,通过western blot方法检测自噬标志蛋白BECN1、LC3II/I表达变化、透射电镜观察自噬体以及GFP-m RFP-LC3双荧光示踪系统检测自噬流来确定uc.88在心肌细胞自噬中的作用;通过检测心肌细胞表面积及肥厚标志物Nppa和Nppb表达变化来明确uc.88对心肌肥厚的调控作用。（三）uc.88通过促进心肌细胞自噬抑制心肌肥厚的机制研究通过生物信息分析方法确定uc.88基因位点附近区域仅存在TANK。经q RT-PCR的方法检测AC16心肌细胞、原代大鼠心肌细胞和原代小鼠心肌细胞的TANK的表达。通过q RT-PCR和western blot方法检测抑制uc.88后TANK在m RNA和蛋白水平的表达变化;通过q RT-PCR检测过表达/抑制TANK后uc.88的表达变化。经RIP实验鉴定uc.88与TANK的结合作用。通过腺病毒载体转染原代大鼠心肌细胞过表达TANK,测定转染效率后进行血管紧张素II诱导刺激,通过检测自噬标志蛋白BECN1、LC3II/I表达变化、透射电镜观察自噬体以及GFP-m RFP-LC3双荧光示踪系统检测自噬流来确定TANK在心肌细胞自噬中的作用;通过检测心肌细胞表面积及肥厚标志物Nppa和Nppb表达变化来明确TANK对心肌肥厚的调控作用。在心肌细胞中同时抑制uc.88和TANK,或抑制uc.88和过表达TANK,利用血管紧张素II诱导心肌细胞自噬,通过检测自噬标志蛋白表达和自噬流数量变化确定心肌细胞自噬活性改变,通过western blot确定相关自噬信号通路的变化。在血管紧张素II刺激诱导心肌肥厚模型中,分别以:uc.88的小干扰RNA+自噬促进剂（Rapa）和uc.88的小干扰RNA+自噬抑制剂（3-MA）方式干预心肌细胞,通过检测心肌细胞表面积、心肌肥厚标志物、自噬标志物确定uc.88调控心肌肥厚的机制。最后,在血管紧张素II缓释泵构建的小鼠心肌肥厚动物模型上,明确uc.88抑制剂给药对心肌肥厚病程的效果。研究结果（一）心肌细胞自噬和肥厚过程中lnc RNAs/m RNAs差异表达通过胶原酶消化联合差速贴壁法,成功分离获得原代大鼠心肌细胞。血管紧张素II刺激心肌细胞12小时后,自噬蛋白BECN1和LC3II/I表达水平明显升高,同时透射电镜结果显示心肌细胞中自噬小体数量增加,而此时心肌细胞表面积无明显变化,提示自噬模型构建成功。血管紧张素II刺激48小时后,心肌细胞表面积显著增大的同时,心肌细胞自噬活性有所下降。利用lnc RNA芯片筛选出在心肌细胞自噬过程中共有1249个显著差异表达的lnc RNAs和197个差异表达的m RNAs,其中差异表达的T-UCRs共有43个,绝大多数差异表达的lnc RNAs为基因间lnc RNAs;在心肌细胞肥厚过程共有1577个显著差异表达的lnc RNAs和496个m RNAs差异表达,其中共筛选59个差异表达的T-UCRs,大部分差异表达的lnc RNAs为基因间lnc RNAs。只有uc.88、uc.233和uc.378三个T-UCRs在心肌细胞自噬和肥厚过程中均为差异表达,uc.88和uc.233表达上调,uc.378表达下调。GO分析及pathway分析结果提示自噬过程中差异表达的基因主要与细胞能量和代谢通路有关,肥厚过程中差异表达的基因主要与上皮-间质转化及胰岛素分泌调节通路有关。（二）uc.88在心肌细胞自噬及肥厚中的功能研究血管紧张素II刺激原代大鼠心肌细胞12小时后,uc.88的表达水平明显升高,随着刺激时间的延长,uc.88表达稳定,并且呈现时间依赖性升高变化;而在血管紧张素II刺激后,uc.233的表达先升高后降低,随后又逐渐升高的过程;uc.378的表达先下降后上升,刺激24小时后其表达又逐步降低。在AC16心肌细胞和小鼠心肌细胞中,uc.88的表达在血管紧张素II刺激后,表达升高,并呈现时间依赖性,与原代大鼠心肌细胞中的表达一致。核质分离试验结合q RT-PCR分析揭示uc.88在细胞质与细胞核均有分布。原代大鼠心肌细胞中抑制uc.88的表达后,自噬蛋白BECN1和LC3II/I表达水平明显降低,自噬小体以及自噬流的数量显著减少。抑制uc.88后,心肌细胞表面积显著增大,Nppa和Nppb表达水平也明显升高。（三）uc.88通过促进心肌细胞自噬抑制心肌肥厚的机制研究生物信息分析方法发现uc.88基因位点附近区域仅存在TANK。血管紧张素II分别刺激原代大鼠心肌细胞、AC16心肌细胞和原代小鼠心肌细胞后,q RT-PCR结果显示,TANK在不同种属心肌细胞中表达稳定并且具有一致性,呈现时间依赖性升高变化。在人和大鼠心肌细胞中,抑制uc.88可以降低TANK的表达。过表达TANK/抑制TANK不影响心肌细胞中uc.88的表达。RIP实验结果表明,uc.88可以与TANK特异性结合。过表达TANK后,心肌细胞中BECN1和LC3II/I表达升高,自噬小体以及自噬流的数量增加;心肌细胞表面积减小,Nppa和Nppb表达下降。共同抑制uc.88和TANK,心肌细胞中BECN1和LC3II/I表达显著下降、自噬小体数量明显减少;而抑制uc.88和过表达TANK后,心肌细胞中BECN1和LC3II/I表达升高、自噬小体数量增加;同时AMPK和m TOR信号通路被激活。自噬促进剂Rapa可以促进uc.88诱导的自噬活性而抑制血管紧张素II诱导的心肌肥厚,自噬抑制剂3-MA抑制uc.88诱导的自噬而促进血管紧张素II诱导的心肌肥厚。最后,在血管紧张素II缓释泵构建的小鼠心肌肥厚动物模型中,注射uc.88抑制剂能够加剧小鼠心肌肥厚进程。研究结论（一）血管紧张素II（0.1umol/L）刺激原代大鼠心肌细胞12小时后,成功构建心肌细胞自噬模型;刺激48小时后,成功构建心肌肥厚模型。（二）三个T-UCRs（uc.88,uc.233,uc.378）在心肌细胞自噬和肥厚模型中均是差异表达,uc.88的表达稳定,并在血管紧张素II刺激后呈时间依赖性增加。（三）抑制uc.88后能够抑制血管紧张素II诱导的心肌细胞自噬,促进血管紧张素II诱导的心肌肥厚。（四）过表达TANK促进血管紧张素II诱导的心肌细胞自噬,抑制血管紧张素II诱导的心肌肥厚。（五）uc.88通过调控TANK表达促进心肌细胞自噬,进而抑制血管紧张素II诱导的心肌肥厚。