论文部分内容阅读
心力衰竭（heart failure,HF）是一种由损害心室充血或排血能力的结构性或功能性心脏疾病引起的复杂的临床综合征,常见的原因包括心肌梗死和压力超负荷等。尽管近年来在心力衰竭的治疗上有一定的进展,但仍然具有较高的发病率和死亡率,给社会造成重大经济和公共卫生问题。对心力衰竭的发生发展机理仍需要更多的研究以提供理论支持。微小核糖核酸（micro RNA,mi RNA）是一种长约18-22个核苷酸,对基因表达具有转录后调节活性的单链小分子RNA,参与机体多种生物学进程的调控,与多种心血管疾病的发生有关联。压力超负荷诱导的心衰小鼠模型中,包含mi R-21,mi R-23a,mi R-23b,mi R24,mi R-195,mi R-199a,mi R-214,mi R125b,mi R-133a,mi R-150,mi R-181b等多种mi RNA表达异常。MiRNA发挥生物学功能需要一系列蛋白酶的加工,首先mi RNA基因转录形成原始mi RNA（primary mi RNA,pri-RNA）,经过Drosha酶加工形成前体mi RNA（precursor mi RNA,pre-RNA）,再经Dicer酶剪切形成成熟mi RNA,通过RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）的形式与靶基因结合,促进其降解或者翻译抑制。RNA可变剪接是转录后基因表达调控的另一普遍调控机制。真核生物的基因由外显子和内含子交错排列而成,进一步可通过转录因子的作用转录成前体信使RNA（messenger RNA,m RNA）。这些前体m RNA借助RNA剪接体的作用,内含子被剪去,外显子相互连接,最终形成了成熟的m RNA,最后成熟的m RNA作为蛋白质翻译过程模板。但是,大量的外显子的界定并不绝对,一系列细胞内外环境的变化都可以调控前体m RNA的剪接过程,导致不同的m RNA亚型形成,进而翻译成可能存在显著差异的蛋白质亚型。Drosha是mi RNA加工成熟的关键酶,通过查阅相关数据库及既往文献,我们发现Drosha存在可变剪接,主要存在Drosha-L/Drosha-S这两种亚型,结合心衰中异常表达的多种mi RNAs,我们推测Drosha的可变剪接可能参与调控心脏的机构及功能。为此,我们设计本研究对Drosha的可变剪接在心脏结构及功能的作用进行探讨,并进一步探索Drosha可变剪接对心脏结构功能的调控机制。第一部分Drosha可变剪接在心肌梗死及压力超负荷心衰模型中的异常转换目的:验证Drosha存在可变剪接并探究其在心肌梗死及压力超负荷心衰中的异常转换。方法:1、抽取大鼠各组织RNA,通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）琼脂糖凝胶电泳的方法检测mi RNA合成的各关键酶的表达。2、通过冠状动脉结扎法构建心肌梗死模型;以主动脉弓缩窄（Transverse Aortic Constriction,TAC）的方法构建压力超负荷心衰模型,并以实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RT-q PCR）方法检测心功能标志物的表达,苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）检测心脏结构变化。3、RT-q PCR方法检测Drosha-L及Drosha-S的在心梗及心衰模型中的表达,计算Drosha-L/S比例的变化。结果:查阅既往文献及数据库确认Drosha主要存在Drosha-L及Drosha-S两种亚型,区别在于Exon 7的跳跃,并且通过PCR验证了其在大鼠各组织及心脏中存在上述可变剪接。心梗大鼠心电图R波升高及ST段抬高,HE染色及心功能标志物的检测提示TAC组大鼠心肌增厚,ANP、BNP及MYH7表达升高,提示模型构建成功。Drosha-L/S在心梗后8h及12h明显下降,TAC心衰大鼠Drosha-L/S明显升高。结论:Drosha存在可变剪接,Drosha Exon 7跳跃产生Drosha-L及Drosha-S两种亚型,并且在心肌梗死及心力衰竭状态下Drosha的可变剪接发生异常转换。第二部分Drosha的可变剪接转换对心脏结构功能的影响目的:探究Drosha的可变剪接转换对心脏结构、心功能以及心肌细胞增殖能力的影响。方法::1、通过CRISPR-Cas9基因敲除技术获得Drosha Exon 7敲除大鼠,并杂交培育获得不同基因型敲除大鼠,通过基因组鉴定及心脏组织PCR方法明确基因型。2、通过心脏超声和（或）血流动力学的方法检测不同基因型的不同年龄段大鼠及压力超负荷心衰大鼠的心脏功能,并通过RT-q PCR方法检测心功能标志物,HE染色的方法检测心脏结构的变化。3、通过PCNA免疫组化染色的方法检测4周龄大鼠PCNA表达。4、通过western blot的方法检测不同基因型的不同年龄段大鼠及压力超负荷心衰大鼠的细胞增殖相关蛋白的表达。结果:1、CRISPR-Cas9成功构建Drosha Exon 7敲除大鼠,基因组鉴定可明确大鼠基因型。2、心脏超声检测发现4周龄大鼠心功能无明显差别,血流动力学提示14周成年Drosha Exon 7敲除大鼠与野生型大鼠心脏LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax无明显差别,Drosha Exon 7+/-及Drosha Exon 7-/-的Lvedp明显降低,提示前负荷降低。RT-q PCR结果提示4周龄及14周龄Drosha Exon 7敲除大鼠心功能标志物ANP、BNP、MYH6及MYH7表达降低。HE染色提示4周龄及14周龄不同基因型大鼠心肌细胞大小及室壁厚度无明显差异。3、心脏超声提示1年龄Drosha Exon 7敲除大鼠的EF值、FS、LVPW;d与LVPW;s较野生型相比均明显升高;血流动力学提示1年龄Drosha Exon 7敲除大鼠的LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax明显高于野生型大鼠,RT-q PCR检测ANP、BNP明显降低,MYH6明显升高。HE染色结果显示Drosha Exon7敲除大鼠心肌细胞明显增大,心脏室壁厚度增加。4、Drosha Exon 7-/-TAC术后生存率明显低于野生型。血流动力学结果显示压力超负荷模型的Drosha Exon 7敲除大鼠LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明显低于野生型大鼠,RT-q PCR检测ANP、BNP明显升高。HE染色提示Drosha Exon 7敲除大鼠心肌细胞明显增大,心脏室壁厚度明显高于野生型大鼠。5、PCNA免疫组化染色结果发现4周龄Drosha Exon 7敲除大鼠PCNA表达降低。WB方法测定细胞增殖相关蛋白结果提示4周龄Drosha Exon 7敲除大鼠Cyclin A及PCNA表达降低,14周龄及压力超负荷模型的Drosha Exon 7敲除大鼠Cyclin A、Cyclin B及PCNA表达增高,1年龄不同基因型大鼠Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D2、Cyclin D3、PCNA及BCL2表达均无明显差别。结论:Drosha Exon 7敲除不影响心脏发育,可以减轻成年大鼠心脏前负荷。Drosha Exon 7敲除可通过心肌肥厚改善衰老所致心力衰竭。Drosha Exon 7敲除在压力超负荷心衰的病理情况下加重心肌肥厚促进心衰发展。Drosha Exon 7敲除可以抑制4周龄大鼠心肌细胞的增殖,促进14周龄大鼠心肌细胞增殖,压力超负荷心衰的病理条件同样保持促进增殖的作用,但随着年龄增长至1年龄而消失。第三部分Drosha可变剪接转换调控心脏结构功能的机制探索目的:探索Drosha可变剪接转换调控心脏的结构、心功能与心肌细胞增殖能力的机制。方法:1、RT-q PCR方法检测4周龄大鼠Drosha Exon 7敲除对mi RNAs表达的影响。2、转录组测序的方法检测4周龄大鼠Drosha Exon 7敲除的差异表达基因,并通过生物信息学的方法分析相关的信号通路变化。3、通过mi RTar Base数据库分析mi RNA与Hub-Gene调控网络。4、通过Western Blot的方法检测Drosha Exon 7敲除不同年龄及压力超负荷心衰模型的各基因型大鼠心肌肥厚相关信号通路蛋白的表达。结果:1、通过RT-q PCR检测4周龄不同基因型大鼠mi RNAs表达,结果发现Drosha Exon 7敲除可降低多种功能不一的mi RNAs表达。2、转录组测序结果经生物信息学分析以及RT-q PCR验证筛选基因发现4周龄Drosha Exon 7敲除与野生型差异基因主要富集于细胞周期,这些基因受多种mi RNAs调控。3、WB方法检测心肌肥厚相关信号通路蛋白在4周龄、14周龄、1年龄及压力超负荷心衰模型大鼠中的表达,结果发现4周龄Drosha Exon 7敲除大鼠的MKK6、P-MKK3/6、P-P38表达较野生型明显降低。14周龄Drosha Exon 7敲除大鼠的MKK6、MKK3、m TOR及P-m TOR的表达均明显降低,而SRC、P-ERK及AKT的表达均明显升高;但P-PLCγ、P-P38及P-AKT在杂合子与纯合子表达不一,Drosha Exon 7+/-表达降低而Drosha Exon 7-/-无明显差异。1年龄Drosha Exon 7敲除的大鼠P-PLCγ、PKA、P-PKA、SRC、P-P38的表达明显降低,ERK和P-ERK的表达则明显升高;Drosha Exon 7+/-的P-AKT、m TOR及P-m TOR表达水平与野生型相较明显升高而Drosha Exon 7-/-无明显差异。压力超负荷心衰模型中,Drosha Exon 7敲除大鼠的P-PKA、P-ERK、MKK6、MKK3、P-MKK3/6、P-P38、MAPKAPK2、P-MAPKAPK2以及P-m TOR表达均明显升高,P-PLCγ及SRC的表达水平均明显降低;Drosha Exon 7-/-的ERK表达降低,m TOR表达升高而Drosha Exon 7+/-无明显差异;Drosha Exon 7+/-的P-AKT表达明显降低而Drosha Exon 7-/-则未见明显改变。结论:Drosha可变剪接的异常转换改变了多种mi RNAs的表达,这些mi RNAs共同作用通过调控细胞周期信号通路调控心肌细胞的增殖。Drosha可变剪接可能通过多种mi RNAs共同参与调节心脏的结构与功能。MAPK及AKT信号通路参与了Drosha可变剪接转换对心肌肥厚的调控,P38 MAPK信号通路的不同变化可能是Drosha Exon 7敲除造成生理性与病理性心肌肥厚差异的主要原因。