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目的：
眼底的新生血管性疾病已经成为全球致盲的主要原因之一。最新研究表明，COX-2在视网膜血管发育和病理性血管生成过程中具有促进血管生成的作用，而COX-2是PGE2和PGF2α的合成酶，因此COX-2发挥其对新生血管作用可能由二者介导。PGF2α已被证明在女性生殖系统及多种类型肿瘤的血管生成中发挥着重要作用，因此推测COX-2通过诱导合成前列腺素F2α调控视网膜新生血管的生成。因此，本课题将利用基因敲除小鼠并构建视网膜新生血管模型，明确前列腺素F2α受体（PTGFR）是否调控视网膜新生血管的生成，并初步探索其调控血管新生的细胞和分子机制。
方法：
本课题分为三大部分：
1.明确PTGFR对视网膜血管发育和病理性血管新生的作用。(1)首先明确PTGFR敲除对视网膜正常血管发育的影响：对PTGFR敲除小鼠及其同窝野生型小鼠于P3、P7、P12进行视网膜铺片，Isolectin GS-IB4渲染血管内皮细胞，使用AngioTool统计视网膜的血管密度和长度及血管分支点数。（2）观察在高氧环境下PTGFR敲除对血管生成的影响：对PTGFR敲除小鼠及其同窝野生型小鼠进行氧诱导视网膜病变（OIR）造模，即P0至P6天在正常空气环境下饲养，在P7天进入75％高氧氧舱环境，P12天时出氧舱并取材，Isolectin GS-IB4渲染血管内皮细胞，统计无血管灌注区所占整个视网膜面积的比例；观察在相对低氧环境下PTGFR敲除对血管生成的影响，通过对PTGFR敲除小鼠及其同窝野生型小鼠进行OIR造模，P12天出氧舱后返回正常空气饲养环境，在P17天取材，Isolectin GS-IB4渲染血管内皮细胞，分别统计无血管灌注区所占整个视网膜面积的比例、病理性新生血管占整个视网膜面积的比例。
2.探索PTGFR敲除对视网膜血管和神经细胞的影响，明确PTGFR调控血管发育的细胞机制。首先对PTGFR敲除小鼠及其同窝野生型小鼠OIR造模，并在P17取材进行视网膜铺片，Isolectin GS-IB4渲染血管内皮细胞，统计血管内皮细胞中的具有丝状伪足的Tip cell个数并进行分析；接着对PTGFR敲除小鼠及其同窝野生型小鼠OIR造模在P17取材，进行视网膜冰冻切片和免疫荧光染色：使用EDU标记增殖的细胞、Tunnel标记凋亡的细胞，统计分析视网膜细胞增殖和凋亡的个数。
3.探索PTGFR调控血管生成的分子机制。将C57BL/6同窝小鼠随机分为两组，分别进行OIR造模和不造模，在P17天取材提取视网膜RNA并进行实时荧光定量PCR,统计分析PTGFR下游通路中AKR1B1、PCK1、mpges-1、mpges-2、Cpges、CAMKⅡα、CAMKⅡβ、CAMKⅡγ、CAMKⅡδ、G7pase的mRNA水平；通过对PTGFR敲除小鼠及其同窝野生型小鼠进行OIR造模，在P17天取材提取视网膜RNA并进行实时荧光定量PCR，统计分析影响血管生成的经典通路中RAS系统的AT1R，NO通路中的eNOS和iNOS以及直接影响血管生成的VEGF的mRNA水平。
结果：
1.明确PTGFR对视网膜血管发育和病理性血管新生的作用：首先，在P3、P7、P12天视网膜血管正常发育过程中，PTGFR敲除小鼠与同窝野生型小鼠相比，血管密度，分支点数和血管长度没有统计学差异。但在OIR造模的P12天时，PTGFR敲除小鼠与野生型小鼠相比，无灌注区明显增加（P<0.05，independent t-test）。在OIR模型的相对低氧阶段视网膜病理性新生血管的生成过程中，敲除组的病理性新生血管面积占整个视网膜面积比例与野生型组相比明显降低（P<0.01，independent t-test）,无灌注区面积占整个视网膜面积比例，敲除组与野生型组相比明显增加（P<0.05，independent t-test）。
2.探索PTGFR敲除对视网膜血管和神经细胞的影响，明确PTGFR调控血管发育的细胞机制。进行OIR造模后，PTGFR敲除小鼠与同窝野生型小鼠相比新生血管内皮细胞的Tip cell和增殖细胞的个数没有明显统计学差异；但PTGFR敲除小鼠与同窝野生型小鼠相比，细胞凋亡的个数明显增加（P<0.05，independent t-test）。3.探索PTGFR调控血管生成的分子机制。在PTGFR下游通路中，C57BL/6小鼠OIR造模组与同窝不进行OIR造模组相比，CAMKⅡα、CAMKⅡβ、CAMKⅡγ的mRNA表达明显降低（P<0.05，independent t-test）；C57BL/6小鼠OIR造模组与同窝不进行OIR造模组相比，CAMKⅡδ的mRNA表达明显升高（P<0.05，independent t-test）。而其他PTGFR下游通路中相关因子AKR1B1、PCK1、mpges-1、mpges-2、Cpges、G7pase的mRNA水平没有明显差异（P＞0.05，independent t-test）。对调节血管生成的其他主要因子AT1R，敲除组与野生型小鼠相比AT1R的mRNA表达水平明显增高(P<0.05，independent t-test)。敲除组与野生型小鼠相比VEGF的mRNA表达水平明显增高(P<0.05，independent t-test）。敲除组与野生型小鼠相比iNOS和eNOS的mRNA表达水平没有明显差异。
结论：
PTGFR在视网膜新生血管的生成中发挥着重要的调控作用。1)敲除PTGFR可以抑制在高氧和相对低氧环境下的新生血管生成。2)敲除PTGFR增加视网膜细胞的凋亡从而抑制新生血管生成。3)PTGFR通过调控CAMKⅡ对血管的生成产生影响。
敲除PTGFR可引起视网膜细胞凋亡、抑制生理和病理性血管生成，表明PTGFR可促进血管发育和病理性血管新生，这一作用可能由CAMKII通路介导。PTGFR敲除与COX-2抑制剂作用一致，提示COX-2可能通过PGF2α-PTGFR信号通路调控视网膜血管生成。
眼底的新生血管性疾病已经成为全球致盲的主要原因之一。最新研究表明，COX-2在视网膜血管发育和病理性血管生成过程中具有促进血管生成的作用，而COX-2是PGE2和PGF2α的合成酶，因此COX-2发挥其对新生血管作用可能由二者介导。PGF2α已被证明在女性生殖系统及多种类型肿瘤的血管生成中发挥着重要作用，因此推测COX-2通过诱导合成前列腺素F2α调控视网膜新生血管的生成。因此，本课题将利用基因敲除小鼠并构建视网膜新生血管模型，明确前列腺素F2α受体（PTGFR）是否调控视网膜新生血管的生成，并初步探索其调控血管新生的细胞和分子机制。
方法：
本课题分为三大部分：
1.明确PTGFR对视网膜血管发育和病理性血管新生的作用。(1)首先明确PTGFR敲除对视网膜正常血管发育的影响：对PTGFR敲除小鼠及其同窝野生型小鼠于P3、P7、P12进行视网膜铺片，Isolectin GS-IB4渲染血管内皮细胞，使用AngioTool统计视网膜的血管密度和长度及血管分支点数。（2）观察在高氧环境下PTGFR敲除对血管生成的影响：对PTGFR敲除小鼠及其同窝野生型小鼠进行氧诱导视网膜病变（OIR）造模，即P0至P6天在正常空气环境下饲养，在P7天进入75％高氧氧舱环境，P12天时出氧舱并取材，Isolectin GS-IB4渲染血管内皮细胞，统计无血管灌注区所占整个视网膜面积的比例；观察在相对低氧环境下PTGFR敲除对血管生成的影响，通过对PTGFR敲除小鼠及其同窝野生型小鼠进行OIR造模，P12天出氧舱后返回正常空气饲养环境，在P17天取材，Isolectin GS-IB4渲染血管内皮细胞，分别统计无血管灌注区所占整个视网膜面积的比例、病理性新生血管占整个视网膜面积的比例。
2.探索PTGFR敲除对视网膜血管和神经细胞的影响，明确PTGFR调控血管发育的细胞机制。首先对PTGFR敲除小鼠及其同窝野生型小鼠OIR造模，并在P17取材进行视网膜铺片，Isolectin GS-IB4渲染血管内皮细胞，统计血管内皮细胞中的具有丝状伪足的Tip cell个数并进行分析；接着对PTGFR敲除小鼠及其同窝野生型小鼠OIR造模在P17取材，进行视网膜冰冻切片和免疫荧光染色：使用EDU标记增殖的细胞、Tunnel标记凋亡的细胞，统计分析视网膜细胞增殖和凋亡的个数。
3.探索PTGFR调控血管生成的分子机制。将C57BL/6同窝小鼠随机分为两组，分别进行OIR造模和不造模，在P17天取材提取视网膜RNA并进行实时荧光定量PCR,统计分析PTGFR下游通路中AKR1B1、PCK1、mpges-1、mpges-2、Cpges、CAMKⅡα、CAMKⅡβ、CAMKⅡγ、CAMKⅡδ、G7pase的mRNA水平；通过对PTGFR敲除小鼠及其同窝野生型小鼠进行OIR造模，在P17天取材提取视网膜RNA并进行实时荧光定量PCR，统计分析影响血管生成的经典通路中RAS系统的AT1R，NO通路中的eNOS和iNOS以及直接影响血管生成的VEGF的mRNA水平。
结果：
1.明确PTGFR对视网膜血管发育和病理性血管新生的作用：首先，在P3、P7、P12天视网膜血管正常发育过程中，PTGFR敲除小鼠与同窝野生型小鼠相比，血管密度，分支点数和血管长度没有统计学差异。但在OIR造模的P12天时，PTGFR敲除小鼠与野生型小鼠相比，无灌注区明显增加（P<0.05，independent t-test）。在OIR模型的相对低氧阶段视网膜病理性新生血管的生成过程中，敲除组的病理性新生血管面积占整个视网膜面积比例与野生型组相比明显降低（P<0.01，independent t-test）,无灌注区面积占整个视网膜面积比例，敲除组与野生型组相比明显增加（P<0.05，independent t-test）。
2.探索PTGFR敲除对视网膜血管和神经细胞的影响，明确PTGFR调控血管发育的细胞机制。进行OIR造模后，PTGFR敲除小鼠与同窝野生型小鼠相比新生血管内皮细胞的Tip cell和增殖细胞的个数没有明显统计学差异；但PTGFR敲除小鼠与同窝野生型小鼠相比，细胞凋亡的个数明显增加（P<0.05，independent t-test）。3.探索PTGFR调控血管生成的分子机制。在PTGFR下游通路中，C57BL/6小鼠OIR造模组与同窝不进行OIR造模组相比，CAMKⅡα、CAMKⅡβ、CAMKⅡγ的mRNA表达明显降低（P<0.05，independent t-test）；C57BL/6小鼠OIR造模组与同窝不进行OIR造模组相比，CAMKⅡδ的mRNA表达明显升高（P<0.05，independent t-test）。而其他PTGFR下游通路中相关因子AKR1B1、PCK1、mpges-1、mpges-2、Cpges、G7pase的mRNA水平没有明显差异（P＞0.05，independent t-test）。对调节血管生成的其他主要因子AT1R，敲除组与野生型小鼠相比AT1R的mRNA表达水平明显增高(P<0.05，independent t-test)。敲除组与野生型小鼠相比VEGF的mRNA表达水平明显增高(P<0.05，independent t-test）。敲除组与野生型小鼠相比iNOS和eNOS的mRNA表达水平没有明显差异。
结论：
PTGFR在视网膜新生血管的生成中发挥着重要的调控作用。1)敲除PTGFR可以抑制在高氧和相对低氧环境下的新生血管生成。2)敲除PTGFR增加视网膜细胞的凋亡从而抑制新生血管生成。3)PTGFR通过调控CAMKⅡ对血管的生成产生影响。
敲除PTGFR可引起视网膜细胞凋亡、抑制生理和病理性血管生成，表明PTGFR可促进血管发育和病理性血管新生，这一作用可能由CAMKII通路介导。PTGFR敲除与COX-2抑制剂作用一致，提示COX-2可能通过PGF2α-PTGFR信号通路调控视网膜血管生成。