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实验背景及目的:再灌注治疗是缺血性心脏病发生急性血管堵塞时治疗的关键,然而,再灌注常常并发缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI),可加重心肌损伤,导致病情恶化。I/RI的发生发展机制复杂,目前尚未完全阐明。内皮细胞-心肌细胞的相互作用在调节心脏功能中占有重要地位,但其相互作用的机制仍不明确。研究显示,内皮细胞可以促进心肌细胞存活,减少缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤。前期研究证实,I/RI的发生与冠状动脉微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)和心肌细胞的凋亡密切相关,我们前期研究显示,胰岛素通过抑制CMECs和心肌细胞的凋亡,从而保护缺血/再灌注心脏。但在此过程中,这两种细胞之间的相互作用有待进一步研究。神经调节蛋白-1(neuregulin-1,NRG-1)是一种表皮生长因子,可以保护心脏并促进心脏发育成熟,主要由内皮细胞合成释放。但在I/RI过程中,CMECs是否能释放NRG-1,释放的NRG-1是否能促进心肌细胞存活,尚未见报道。研究报道,NRG-1可作用于Erb B2受体激活ERK使其发生磷酸化,同时,ERK1/2可调节COX-2表达,对I/RI的心肌起保护作用。然而,在CMECs-心肌细胞共培养时,ERK是否在NRG-1保护缺血/再灌注心肌中起重要作用,以及ERK与COX-2是否有关联仍不明确。因此,本实验通过建立CMECs-心肌细胞相互作用的实验模型,并模拟缺血/再灌注损伤(simulated ischemia reperfusion,SI/R),观察I/RI是否刺激CMECs释放NRG-1,NRG-1是否可以保护缺血/再灌注心肌,并初步探讨其发生机制。实验方法:1.分离培养大鼠冠脉微血管内皮细胞和心肌细胞,建立模拟缺血/再灌注模型和CMECs-心肌细胞共培养实验模型。根据研究对象的不同,CMECs随机分为对照组,SI/R组和SI/R+Ins(10-7mol/L)组,并分别收集各组的培养上清。而心肌细胞随机分为以下7组:对照组,SI/R组,SI/R+Coculture(共培养)组,SI/R+Coculture+anti-Erb B2(Erb B2抑制剂)组,SI/R+NRG-1组,SI/R+NRG-1+anti-Erb B2组,SI/R+NRG-1+PD(ERK1/2抑制剂PD98059)组。2.心肌细胞的活性和凋亡指数分别用MTT法和TUNEL法检测进行检测,Western blot法检测CMECs培养上清中N RG-1表达、心肌细胞Erb B2、ERK和COX-2蛋白或磷酸化水平,Caspase-3酶活性反应心肌细胞凋亡。结果:1.成功分离培养CMECs和心肌细胞,并建立了SI/R模型和CMECs-心肌细胞共培养模型。2.SI/R(4 h/4 h)组的心肌细胞活性比对照组明显降低(P<0.01),而SI/R+Coculture组细胞活性较SI/R组升高(P=0.02)。CMECs进行SI/R(4 h/4 h)处理后,诱导NRG-1的释放(2.96±0.30),当给予胰岛素时,NRG-1升高更显著(4.62±0.26)(均为P<0.01)。检测SI/R不同时间的NRG-1分泌量,4 h/4 h时分泌量较对照组增加最显著(P<0.01)。心肌细胞SI/R组凋亡指数和Caspase-3酶活性比对照组明显升高(27.97±0.90比3.58±0.23,P<0.01;375.93±11.76比100.00±0.00,P<0.01)。共培养或NRG-1处理细胞后,凋亡指数和Caspase-3酶活性较SI/R组降低(16.82±1.03比27.97±0.90,P<0.01;166.16±15.15比375.93±11.76,P<0.01),且Erb B2和ERK磷酸化水平以及COX-2表达明显增加(均为P<0.01)。用Erb B2或ERK1/2抑制剂预处理心肌细胞后,共培养和NRG-1的作用消失(均为P<0.01)。结论:I/RI时CMECs可以释放N RG-1,诱导心肌细胞Erb B2磷酸化,激活下游ERK信号通路,上调COX-2表达,从而抑制I/RI诱导的心肌细胞凋亡。