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玉米赤霉烯酮(F-2)广泛存在于小麦、谷物等粮食或饲料中,人类或动物食用受到真菌毒素污染的食物后,会引起潜在的健康危害,因此对食品中的F-2毒素进行有效地监控和快速检测是防止其危害人类健康的重要手段。F-2毒素的免疫分析检测方法的开发与应用主要基于竞争免疫分析模式,然而全抗原的合成与制备主要依赖于化学合成手段,在合成过程中使用的标准品及有毒试剂对操作人员的身体健康存在潜在的危害。越来越多的研究人员开始改进传统抗原的制备方法,寻找真菌毒素的替代物,并开发基于真菌毒素抗原模拟物的绿色免疫分析方法。利用噬菌体展示技术淘选真菌毒素模拟表位,并采用基因工程手段和原核表达体系真菌毒素生物合成全抗原模拟物,该方法可制备成本低廉、性能稳定、简单易得、绿色无毒的真菌毒素化学合成抗原替代物。本研究旨在利用噬菌体展示多肽技术,淘选F-2毒素的环七肽和线性十二肽噬菌体模拟表位,生物合成F-2毒素全抗原作为传统化学合成抗原的替代物,以期对比分析环七肽和线性十二肽的模拟表位在噬菌体和生物合成全抗原两种形式下免疫分析性能的差异,并探究生物合成全抗原模拟物在免疫学检测分析方法中的应用。主要研究内容及结果如下:1.以抗F-2单克隆抗体作为靶分子,利用噬菌体展示技术分别从噬菌体展示环七肽和线性十二肽文库中淘选F-2毒素噬菌体多肽模拟表位,并建立了环七肽及线性十二肽噬菌体模拟表位介导的间接竞争Phage-ELISA标准曲线;阳性克隆经测序分析,结果显示总计获得9种不同氨基酸序列的噬菌体展示环七肽及7种线性十二肽,建立的标准曲线半抑制浓度(IC50)分别为0.07-0.82 ng/mL和0.33-0.87 ng/mL,且基于环七肽噬菌体模拟表位的免疫分析灵敏度普遍高于线性十二肽。2.采用分子克隆技术,将噬菌体展示模拟F-2毒素表位的环七肽(Z7-1/6/9)和十二肽(Z12-1/2/6)基因分别克隆至pMAL-pⅢ载体中,成功构建Peptide-MBP融合表达载体后导入至E.coli TB1诱导表达,共获得4种基于环七肽的F-2生物合成全抗原:Z7-1A-MBP、Z7-1B-MBP、Z7-6-MBP 及 Z7-9-MBP,将其作为包被抗原建立的间接竞争ELISA(ic-ELISA)具有典型的竞争抑制“S”型曲线,IC50分别为 0.36±0.01、0.39±0.02、0.43±0.02 和 2.13±0.10ng/mL;此外,获得3种基于不同氨基酸序列线性十二肽的F-2全抗原融合蛋白:Z12-1-MBP、Z12-2-MBP 及 Z12-6-MBP,其建立的 ic-ELISA 标准曲线 IC50分别为 0.57±0.01、3.66±0.09 和 5.44±0.10 ng/mL。3.以噬菌体克隆展示的多肽Z7-4和Z12-2作为目的基因,克隆至pET-22b-Nluc载体中,构建了基于环七肽和十二肽的荧光素酶融合表达载体,经IPTG诱导表达,获得Z7-4-Nluc和Z12-2-Nluc融合蛋白。将其作为包被抗原时,分别建立了间接竞争ELIS A标准曲线,且IC50分别为0.47±0.02和2.10±0.11 ng/mL。4.在获得FB1、F-2、OTA的生物合成Peptide-MBP全抗原的基础上,将其作为化学合成抗原的替代物,并以QDs/QBs作为信号输出元件,建立了基于生物合成抗原的三重荧光免疫层析试纸条分析方法,在裸眼条件下检测FB1、F-2和OTA的最低检测限分别为0.25 ng/mL、3.0 ng/mL和0.5 ng/mL;特异性分析、加标实验等实验结果表明该荧光免疫层析试纸条具有良好的特异性、准确度及稳定性,此外为了评估实用性,选取玉米、小麦和大米各10个实际样本进行盲样检测,结果显示有六个实际样本检出结果为阳性,并且mFICA实际样本检测结果与UPLC-MS/MS方法检测结果一致。