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[目的]中枢神经系统疾病如卒中或退行性变均可使神经细胞受损、坏死，导致这部分细胞功能的丧失。神经通路的再塑将问题集中在用什么来代替损失掉的细胞，能够分化为神经细胞的干细胞有胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓基质干细胞，前两者因为来源和伦理因素限制了其发展，而骨髓基质干细胞则有着相对广阔的发展前景。骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSC s)，具有多向分化的潜能，属于多能干细胞，在体外特定培养条件下，BMSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及成肌细胞等间充质细胞，甚至还可以分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞与神经元。骨髓基质细胞不仅具有多向分化潜能，而且来源丰富，采集方法简单，体外扩增容易；是细胞与基因治疗的理想工具。目前一般有三种方法可以诱导分化BMSCs为神经细胞——抗氧化剂、生长因子和转基因诱导。在转基因诱导法中我们拟引入Noggin基因——一种胚胎发育过程中的神经诱导基因。Noggin基因是1992年California大学的Harland，R．M．和Smith，W．C．从非洲爪蟾的胚胎中分离出来的。此后发现该基因在胚胎发育中有重要神经诱导作用，尤其是诱导外胚层的背侧发育。作为一种内源性神经诱导信号，它的作用不仅局限于胚胎期，在成年哺乳动物CNS与外周神经系统也可检测到noggin基因的表达。此外，noggin基因亦是目前在体内与体外均被证实有神经诱导作用的神经诱导剂。其神经诱导功能主要是通过拮抗骨形成蛋白(bone morphogenetic protein-4，BMP4)的作用实现的。鉴于以上理论支持，我们构建带有Noggin基因的载体，并将它转染到BMSCs中，预期它能够诱导BMSCs分化为神经细胞，并对分化后的细胞进行检测。[方法]1．用Percoll淋巴细胞分离液分离出大鼠骨髓基质干细胞，并用含20％(体积分数)胎牛血清的α-MEM培养液培养，胰酶消化传代，扩增大鼠骨髓基质细胞。显微镜下观察形态。用台盼兰排斥试验检测大鼠BMSCs细胞活力并绘制BMSCs的生长曲线。2．将构建好的带有目的基因Noggin的质粒转化感受态大肠杆菌株DH5α，挑菌落提取质粒后进行重组体鉴定。用酶切、PCR技术进行鉴定。3．取第四代、第六代BMSC，用脂质体转染法介导Noggin基因进入到骨髓基质干细胞内。观察细胞形态的改变。利用免疫细胞化学技术鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性标记物：神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)以及星形胶质细胞特异性标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。利用RT-PCR技术检测部分参与神经细胞生理功能的基因如NCAM、GAP43、SYN1和星形胶质细胞标志基因GFAP的表达情况。[结果]1．大鼠BMSCs的分离培养用Percoll淋巴细胞分离液对大鼠骨髓细胞悬液作密度梯度离心，取中间的白膜层用细胞培养液冲洗，所得细胞为比较均一的球形单个核细胞，台盼兰染色细胞活力达97.41％±1.01％。接种培养10-14天后，细胞生长达到90％～95％融合，铺满培养瓶瓶底，呈辐射状、栅栏状或漩涡状排列生长，此时进行细胞的首次传代。传3-4代后，可以形成较典型的BMSCs，呈梭形、三角形、多角形，折光性差，立体感不强。大鼠BMSCs生长的第3、6、9代，细胞生长曲线基本相同，近似“S”形。细胞传代后第1、2天，细胞计数数量无明显变化，有的略有减少，第3天细胞数开始增加，到第4天后细胞进入对数生长期，第9天细胞达到生长平台期，至第10天细胞开始衰老，细胞数有所下降。2．经酶切、PCR、DNA序列分析鉴定，所得质粒中有大小约为760bp的Noggin基因。3．BMSC转染带有Noggin基因的表达载体后，可以观察到胞体收缩，折光性增强，形态类似神经细胞；免疫细胞化学方法检测分化细胞表达NSE、MAP-2，未检测到GFAP的表达；RT-PCR产物中含有NCAM、GAP43和SYN1的表达而GFAP缺如。[结论]转染Noggin基因可以诱导BMSCs向神经细胞分化且转染后细胞有部分神经细胞的功能。