菌株Cupriavidus oxalaticus T2同步脱氮除酚特性及代谢机制研究

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苯酚是一种常见的污染物,含酚工业废水来源广、数量大、成分复杂,这类废水不仅含有酚类污染物,通常还存在过量的氮化合物的污染。利用生物法安全有效的去除废水中的污染物是对生态环境和人类健康的重要保护。然而苯酚对微生物有毒害作用,并且会抑制生物脱氮,这严重阻碍了废水中污染物的去除。因此,利用微生物高效地同时去除废水中酚类和氮污染物成为处理含酚废水亟需解决的问题。而目前关于利用单菌株进行苯酚和氮素共降解的研究有限,对其同步脱氮除酚的代谢机制的认识还不够充分。因此,本研究从某炼油厂废水处理的活性污泥中筛选出一株能够同时脱氮除酚的细菌,研究了该菌株同步脱氮除酚的特性,同时结合组学研究,探究了该菌株同步脱氮除酚的代谢特点以及对苯酚的适应性机制。并且利用分子生物学手段鉴定了该菌株中苯酚降解调控蛋白的功能。本文主要研究结果如下:(1)筛选出一株能够同时降解苯酚和脱氮的菌株T2,鉴定为草酸盐贪铜菌Cupriavidus oxalaticus。对菌株T2进行全基因组测序发现该菌株中存在多个基因簇与苯酚降解相关并且具有苯酚邻位途径的全部基因,同时具有完整的反硝化功能。测序结果显示基因组中有多种潜在的功能基因有利于菌株T2对抗苯酚的毒性,包括大量的通用应激蛋白、外排泵蛋白,以及多种分子伴侣、抗氧化蛋白等。(2)环境因子对草酸盐贪铜菌T2异养硝化-好氧反硝化的性能有显著影响。碳源为丁二酸钠、碳氮比为10、p H为6、转速为150 rpm时菌株T2具有最佳的脱氮效率。此外,菌株T2能够完全降解1000 mg/L浓度的苯酚,环境因子也会对菌株降解苯酚产生影响,在初始p H为7-8,转速150 rpm条件下,菌株T2降解苯酚的效率最高。在以氨氮、硝态氮或氨氮与硝态氮混合做为氮源时,菌株T2都可以进行同步脱氮除酚,并且对氨氮的利用优先于硝态氮。结合实时荧光定量PCR确定了菌株T2降解苯酚通过邻位途径,并推断菌株的脱氮途径为NH4+→NO3–→NO2–→NO→N2O→N2。(3)采用数据非依赖性采集(DIA)蛋白质组学方法对草酸盐贪铜菌T2同步脱氮除酚过程中不同阶段的差异表达蛋白进行了分析。推断出菌株T2同步脱氮除酚的关键代谢机制为:菌株降解苯酚能够同时通过邻位途径和对位途径,并且随着时间的推移,相关代谢酶的表达量会增加;菌株氮代谢过程中,在延滞期反硝化作用增强,由氨直接合成谷氨酸途径受到抑制;在对数期反硝化作用减弱,谷氨酸合成相关蛋白表达上调。发现菌株在苯酚胁迫下的部分适应性机制为:改变呼吸链中不同氧亲和力的细胞色素氧化酶的表达来维持能量产生;加强趋化性和鞭毛合成,增强细胞的运动能力;增强硫辛酸和生物素的生物合成;增强多种抗应激酶和分子伴侣合成表达;抑制部分阻遏因子的表达来应对环境压力。(4)对苯酚降解调控蛋白Pht R的功能进行了鉴定,通过构建报告基因融合质粒系统以及凝胶迁移实验验证了转录调控因子Pht R对苯酚羟化酶基因调控作用,并确定了Pht R在启动子上的结合序列。同时发现间甲酚、邻氯苯酚和对硝基酚等酚类化合物也能够激活转录调控蛋白Pht R与启动子的结合。分离筛选得到的能同时脱氮除酚的草酸盐贪铜菌T2丰富了废水处理微生物的应用资源,该菌株同步脱氮除酚机制及其苯酚耐受机理的探究可以为实际应用提供重要的理论基础。
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