【摘 要】
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目的:单纯疱疹病毒性角膜炎（Herpes simplex keratitis,HSK）是因角膜疾病致盲的首要原因,该疾病反复发作导致角膜的透明度降低、视力受损甚至致盲,HSK主要是由1型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）感染引起,HSV-1可直接损伤角膜细胞,病毒触发的免疫反应进一步引起角膜损伤。近几年发现,病毒表面的多种糖蛋白具有很强的免疫原性,本
【基金项目】
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辽宁省自然科学基金（NO:201602844）；
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目的:单纯疱疹病毒性角膜炎（Herpes simplex keratitis,HSK）是因角膜疾病致盲的首要原因,该疾病反复发作导致角膜的透明度降低、视力受损甚至致盲,HSK主要是由1型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）感染引起,HSV-1可直接损伤角膜细胞,病毒触发的免疫反应进一步引起角膜损伤。近几年发现,病毒表面的多种糖蛋白具有很强的免疫原性,本研究构建HSV-1的糖蛋白B（glycoprotein B）和糖蛋白D（glycoprotein D）的T细胞表位重组核酸疫苗,并研究其作为核酸疫苗的免疫原性,预期能够达到预防HSV-1感染的目的,从而降低HSK发病率,同时采用两种方法免疫,确定更合适的免疫方式。方法:登录免疫表位数据库（Immune Epitope Database,IEDB）,查阅已发表的文献中明确具有保护作用的HSV-1的g B和g D的无症状表位（Asymptomatic epitope,ASYMP）,登录Genebank获取HSV-1的g B和g D的氨基酸序列,通过联合运用SYFPEITHI、IEDB生物信息学软件,预测HSV-1的g B和g D的潜在的T细胞表位。将已知表位和预测表位按照各自在基因组上的顺序进行串联合成HSV-1的g B、g D多表位氨基酸序列,利用生物学综合序列分析软件DNAMAN,将合成的多表位氨基酸序列复原成核苷酸序列,同时优化密码子,设计合成多表位基因盒,命名为Tg。将Tg克隆入质粒p VAX,构建真核细胞表达载体p VAX-Tg,p VAX-Tg转染293T细胞,通过Western Blot鉴定其能否正确表达目的蛋白,采取肌肉注射和结膜下注射两种免疫方式免疫小鼠,检测小鼠外周血清中γ干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumour Necrosis Factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）的水平并通过泪腺和结膜的病理学变化评价疫苗产生的粘膜免疫效果。结果:预测出潜在的HSV-1的g B和g D的T细胞表位,成功构建真核细胞表达载体p VAX-Tg,p VAX-Tg成功转染293T细胞,经Western Blot检测p VAX-Tg能够表达目的蛋白,将p VAX-Tg免疫小鼠后,与空载体对照组相比,疫苗实验组小鼠血清中的细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平明显升高（P<0.05）,且两实验组的外周血细胞因子比较,结膜下注射组比肌肉注射组升高更明显（P<0.05）,HE染色结果发现,结膜下注射疫苗后结膜和泪腺中有明显的炎性细胞浸润。结论:本研究成功设计并构建HSV-1的g B和g D的T细胞表位核酸疫苗,该疫苗能够在体外真核细胞中表达,并能够有效诱导细胞免疫,结膜下注射在诱导全身免疫的同时产生了局部粘膜免疫,因此产生了更强的免疫反应,为HSV-1多表位核酸疫苗的研究奠定了坚实基础,为HSK的防治提供新的策略。
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