【摘 要】
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L-2-氨基丁酸（L-ABA）是一种非天然手性氨基酸,作为一种重要的化工原料和药物中间体,L-2-氨基丁酸被广泛用于化学品和药物的合成,如抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦、抗结核药物乙胺丁醇等,L-2-氨基丁酸生产方法包括化学合成法和生物合成法,化学合成法价格高昂同时容易造成环境污染,不利于工业应用,相比之下,生物合成法绿色无污染,更适合L-2-氨基丁酸的绿色合成。L-苏氨酸脱氨酶（TD,EC 4.
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L-2-氨基丁酸（L-ABA）是一种非天然手性氨基酸,作为一种重要的化工原料和药物中间体,L-2-氨基丁酸被广泛用于化学品和药物的合成,如抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦、抗结核药物乙胺丁醇等,L-2-氨基丁酸生产方法包括化学合成法和生物合成法,化学合成法价格高昂同时容易造成环境污染,不利于工业应用,相比之下,生物合成法绿色无污染,更适合L-2-氨基丁酸的绿色合成。L-苏氨酸脱氨酶（TD,EC 4.2.1.6）及ω-转氨酶组成的双酶系统是目前制备L-2-氨基丁酸最常用的生物合成方法之一,该反应的底物是价格低廉的L-苏氨酸（L-Thr）及异丙胺,反应的副产物丙酮易挥发,有利于反应的正向进行和L-2-氨基丁酸的纯化,然而,ω-转氨酶仍然是该级联反应的限速步骤,对ω-转氨酶进行酶分子改造以提升其酶活是一种热门的解决方案。本研究基于半理性设计将α-丁酮酸与苍白杆菌来源的ω-转氨酶（简称OATA,PDB:5GHF）进行分子对接,在α-丁酮酸与活性位点5（?）范围内,选出了六个氨基酸位点进行饱和突变,分别为Y20、L57、W58、G229、A230和M419,共构建114个单点突变。通过薄层层析初筛及高效液相色谱复筛,得到活性明显提升的突变位点,L57A、L57C、A230S和M419I,活性分别提高了1.6倍、2.7倍、1.7倍及2.7倍。接着将活性提高的单点突变进行组合突变,获得的双点突变L57C/M419I活性提高了3.2倍。与野生型中α-丁酮酸的对接模型相比,突变体活性部位α-丁酮酸结合的改变导致底物羰基碳与PMP之间的距离从4.420（?）显著减小到3.455（?）,这可能是催化活性提高的原因之一。分子动力学模拟结果表明,在底物接近活性位点的过程中,I419和底物之间的疏水作用被破坏,C57和α-丁酮酸之间形成氢键,导致底物的羰基碳向PMP转移。底物与突变体活性位点之间的可及性和稳定性的提高可能导致kcat的提高。同时本研究将活性最高的双点突变体与L-苏氨酸脱氨酶进行联用,制备L-2-氨基丁酸,在50 m L反应体系中,300 m M的苏氨酸底物,10 h的转化率为94.09%,最终纯度为75.16%,而野生型转化率为70%。ω-转氨酶双突变体L57C/M419I比野生型具有更高的催化效率,同时不改变产物的构型,在一锅法制备L-2-氨基丁酸的过程中催化效率及转化率的提高可以降低后期L-2-氨基丁酸的纯化成本,有助于工业化应用。
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