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研究目的急性早幼粒细胞白血病（APL）具有特征性的t（15;17）（q22;q21）,表达PML-RARα融合基因及蛋白,导致髓系细胞的正常发育分化受阻,是发生APL的关键因素。作为一种经典的诱导分化剂,全反式维甲酸（ATRA）已经广泛地应用于APL的临床治疗,与三氧化二砷（ATO）具有协同效应,被公认为是肿瘤靶向治疗最成功的范例。它们可以直接或协同作用于PML-RARα融合蛋白,经过泛素-蛋白酶或自噬这两种途径降解致病靶蛋白,又或抑制mTOR激酶从而激活自噬降解融合蛋白,继而促进APL细胞分化。葛根总黄酮（PRF）是葛根的主要有效成分之一,课题组前期研究发现,PRF诱导多种急性白血病细胞株凋亡,以NB4细胞最为显著。近几年来课题组对上述研究结果的分子机制开展原创性渐进性的探索,取得了良好的研究结果。近年来我们发现低浓度PRF（10μg/ml）虽可有效抑制NB4细胞增殖,但并未观察到细胞凋亡,但BCL-2、ERK磷酸化水平和Beclin1蛋白表达却明显增加,与30～50μg/ml PRF处理组变化趋势一致。那么,较低剂量（10μg/ml）的PRF诱导NB4细胞自噬与凋亡有何关联?与细胞分化有无必然联系?自噬在其中可能的作用机制是什么?诸如此类的问题引发了我们进一步深入研究的兴趣,因此,结合相关文献,本研究拟探讨低剂量PRF诱导的NB4细胞自噬在NB4细胞生存及转归中的作用,利用自噬以及MEK/ERK相关信号分子的变化等揭示可能的分子机制。研究方法1.低剂量PRF对NB4细胞自噬表达的影响NB4细胞经梯度浓度（0、5、10、15μg/ml）PRF处理48h,采用蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表达变化;qRT-PCR（quantitative Real-time PCR）技术检测自噬相关基因 ATG5、Beclin1的表达变化;10μg/mlPRF作用48h后,单丹磺酰尸胺（MDC）染色及透射电镜技术检测NB4细胞中自噬小体的变化。2.自噬在低剂量PRF诱导NB4细胞分化的作用NB4细胞经3MA（5mM）预处理1h后,再给予PRF（10μg/ml）作用48h,采用WB检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1以及PML-RARα融合蛋白的表达变化;采用瑞士-吉姆萨染色（Giemsa-Wright’s staining）检测NB4细胞形态学改变情况;采用流式细胞术（FCM）来检测NB4细胞表面分化抗原CD1 1b的表达阳性率以及细胞改变。3.低剂量PRF诱导NB4细胞自噬及分化可能的分子机制NB4细胞经10μg/mlPRF作用48h后,运用WB检测MEK和ERK1蛋白的表达水平。采用该通路抑制剂SCH772984（10μM）预处理NB4细胞1h后,再给予 10μg/mlPRF 作用 48h,WB 检测 ERK1、LC3-Ⅱ、PML-RARα 蛋白表达的变化;MDC染色和Giemsa-Wright’s staining观察NB4细胞中酸性自噬溶酶体和细胞形态学的变化;运用FCM检测NB4细胞表面分化抗原CD1 1b的表达以及细胞周期变化;qRT-PCR技术分析不同浓度梯度（0、5、10、15μg/ml）PRF作用48h后的NB4细胞以及抑制剂SCH772984（10μM）预处理后ERK1、LC3-Ⅱ、PML-RARα在mRNA水平的表达。研究结果1.PRF体外可诱导NB4细胞自噬。PRF（10μg/ml）药物作用48h后自噬水平提升明显,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及Beclin1的表达升高;ATG5及Beclin1在mRNA水平表达增多;PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表达减少;细胞中自噬小体的数量增多。2.自噬抑制剂3MA（5mM）预处理1h,再予以PRF（10μg/ml）作用48h后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表达下调,融合蛋白PML-RARα的表达下调,Beclin1、LC3-Ⅱ、MEK、ERK1在mRNA水平表达减少,PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表达增多;抑制NB4细胞向正常粒细胞分化的形态学也发生改变,阻断自噬也降低了 PRF诱导的CD11b表达下降,抑制了细胞周期阻滞在G0/G1期的现象。3.PRF（10μg/ml）作用NB4细胞48h后可显著上调MEK和ERK1的蛋白表达水平。通路抑制剂SCH772984（10μM）预处理1h后,10μg/ml PRF诱导的ERK1、LC3-Ⅱ的蛋白表达及PML-RARα的降解程度均受抑,Beclin1、LC3-Ⅱ、MEK、ERK1在mRNA水平表达减少,PML-RARα融合蛋白在mRNA水平表达增多;NB4细胞中酸性自噬溶酶体比例下降,抑制细胞形态改变,表面分化抗原CD11b表达下调,表明NB4细胞分化受阻。结论低剂量（10μg/ml）PRF通过激活MEK/ERK信号通路促进NB4细胞的自噬,引起致癌蛋白PML-RARα的降解,最终诱导NB4细胞向正常粒细胞分化。低剂量（10μg/ml）PRF诱导的NB4细胞自噬与分化之间的关系有待进一步通过体内实验验证。