肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是以损害脊髓前角细胞，脑干运动神经核和锥体束为主的一组慢性进行性变性疾病，但是选择性损害运动神经元的机制并不十分清楚。以前的研究表明无论是家族性还是散发性ALS病人均表现出皮层高兴奋性，暗示存在相同的致病机制。另外有研究表明在ALS病人中沿运动皮层传导的皮层内抑制和兴奋通路损害，并且这种损害与病程和临床分期有关。而且携带SOD1突变基因的小鼠在出现临床症状前就已经表现出运动神经元本身固有的高兴奋性。皮层高兴奋性可能引起氧化应激改变、线粒体功能和能量代谢改变，可能导致慢性能量耗竭状态因此推进临床症状的发展。电压门控钠通道在动作电位的产生和传播中的重要作用已经得到公认，在神经元和其它可兴奋细胞膜上电压门控钠通道开放引起动作电位的上升支，所以钠通道激活和失活之间的协调在正常的神经元信号传导中起至关重要的作用。即使很小的改变也可能影响细胞的兴奋性，引起许多疾病。据报道SOD1G93A小鼠在早期甚至是出现临床症状前，电压门控钠通道功能已经发生改变。但是在近些年发现的突变TDP-43所致运动神经元病模型上还没有关于电压门控钠通道性质的研究。姜黄素(1,7-bis[4-hydroxy-3-methoxyphenyl]-1,6-hep-tadiene-3,5-dione)是姜黄素类化合物家族中的一员，有多种生物学和药理学活性如：抗肿瘤，抗疟疾，抗氧化，抗畸变，抑菌，免疫调节和抗炎等作用。双甲氧姜黄素（Dimethoxy Curcumin, DMC）是姜黄素的类似物，是在姜黄素两个自由酚基中添加甲基得到。据报道双甲氧姜黄素在阿尔茨海默病中有抗淀粉样蛋白生成的作用。而且本实验室以前的研究结果表明双甲氧姜黄素对TDP-43转染的NSC34细胞系线粒体有保护作用，在给予这种保护后，电压门控钠通道性质将发生怎样改变，我们并不清楚。因此，我们提出4个问题：1.表达突变TDP-43和野生型TDP-43的运动神经元是否与突变SOD1ALS模型一致，呈现出细胞高兴奋性？2.表达突变TDP-43和野生型TDP-43的运动神经元中，在动作电位产生和传播中起关键作用的电压门控钠通道的电生理特性是否受到影响？3.若给予药物DMC，调节细胞内突变和野生型TDP-43水平，细胞电压门控钠通道功能又是如何改变？4. ALS是一个神经变性病，虽然发病机制还不清楚，但目前并不认为其根本的发病原因是离子通道的异常，那么电压门控钠通道在疾病的产生和进展过程中起什么样的作用？针对以上问题，本课题研究分为两部分，检测表达突变TDP-43和野生型TDP-43的运动神经元样细胞的钠离子通道的电生理特性，分析细胞的兴奋性水平；以及研究给予DMC后，钠离子通道电生理特性和细胞兴奋性的改变。通过这两部分实验结果，分析ALS发病机制中电压门控钠离子通道的作用。第一部分突变或野生型TDP-43对神经元电压门控钠通道电生理特性的影响目的：本研究目的是检测在稳定转染野生型或突变型TDP-43的神经元中电压门控钠通道性质是否发生改变。方法：本实验应用Q331K、WT、Empty和NSC34四种细胞，该细胞系由本实验室构建，参考培养NSC34细胞株的方法进行培养，采用抗生素加压筛选单克隆细胞，采用免疫组化技术鉴定TDP-43蛋白的表达情况，将单克隆细胞系进行培养、传代。用全细胞膜片钳技术检测其电压门控钠通道的性质。结果：Empty组与NSC34组电压门控钠通道所有性质均相似，没有统计学差异。Q331K组与其余三种细胞相比钠电流密度显著增大(Q331K组-30mv-105.516±43.949;-20mv-123.379±45.219; WT组-30mv-55.062±49.624P<0.01;-20mv-71.088±44.544P<0.01; Empty组-30mv-34.041±45.892P<0.001;-20mv-79.986±40.790P<0.05; NSC34组-30mv-53.048±46.427P<0.05),半数激活电压绝对值显著增大(Q331K组-37.121±3.991; WT组-30.141±7.356, P<0.01; Empty组-26.956±5.609,P<0.001; NSC34组-30.686±2.147, P<0.05)，快速失活后恢复速度明显增快(Q331K组τ=4.066±1.422; WT组τ=6.838±2.493P<0.01; Empty组τ=5.695±1.856P<0.05)。Q331K组与NSC34组相比电压门控钠通道进入缓慢失活状态比例明显减小（Q331K组0.709±0.154; NSC34组0.528±0.116, P<0.01)。在不同的预刺激电压条件下Q331K组电压门控钠通道进入缓慢失活状态比例明显减小(在预刺激电压为-20，-10,0，10,20mV时，Q331K组细胞进入缓慢失活状态比例明显比NSC34组小(P<0.05)；在预刺激电压为-60和-20mV时，Q331K组细胞进入缓慢失活状态比例明显比Empty组小（P<0.01）)。在这两种缓慢失活性质上WT组和Q331K组具有相似性，WT组(0.721±0.124)与Empty组(0.606±0.161,P<0.05)和NSC34组(0.528±0.116, P<0.01)相比进入缓慢失活状态比例明显减小。在预刺激电压为-20,-10mV时，WT组进入缓慢失活状态比例明显小于NSC34组（P<0.05）；在预刺激电压为-50,-10mV时, WT组进入缓慢失活状态比例明显小于Empty组（P<0.05）。而四种细胞的激活速率a，给予不同预刺激电压时的失活性质，缓慢失活时的恢复速率均没有统计学差异。小结：1.Empty组与NSC34组相比钠通道所有性质均相似，说明转染的质粒并没有改变NSC34细胞系电压门控钠通道性质。2. Q331K突变TDP-43通过改变激活性质，快速失活及缓慢失活性质，提高了了电压门控钠通道活性，并可能因此增大了动作电位频率和神经元兴奋性。3.野生型TDP-43过表达主要通过改变缓慢失活性质来提高电压门控钠通道活性，并可能因此提高神经元兴奋性，导致神经元变性。第二部分DMC对肌萎缩侧索硬化细胞模型电压门控钠通道的影响目的：本研究的目的是检测DMC对Q331K、WT和Empty组电压门控钠通道性质的影响，探讨DMC对细胞的保护作用及其内在机制。方法：将成功培养的稳定转染Q331K、WT和Empty的NSC34细胞系传代，接种于六孔板小玻璃片上，12小时后更换培养液并给予上述三种细胞10mΜ DMC24小时。给予与对照组相同的刺激程序，观察电压门控钠通道性质的改变情况。结果：三种细胞电流密度比较：WT组（-30mv-7.555±17.681;-20mv-36.178±27.921）明显大于Q331K组(-30mv-4.255±8.174P<0.001;-20mv-28.122±24.506P<0.05), Q331K组(0mv-38.521±21.932)明显大于Empty组(0mv-28.347±10.479P<0.05), WT组在刺激电压为-20、40mv（P<0.01），-10、0、10mv(P<0.001)，20、30mv (P<0.01)时显著大于Empty组。Empty组（-20.286±3.526）半数激活电压明显大于Q331K组（-13.200±3.575P<0.01）和WT组（-13.855±4.123P<0.01）。而三种细胞电压门控钠通道激活速率，给予不同预刺激电压时失活性质，快速失活后的恢复及缓慢失活性质均没有统计学差异。Q331K组细胞给予10μM双甲氧姜黄素处理24小时后，电流密度明显减小(-40-+40mv P<0.001)，半数激活电压显著减小(Drug group-13.200±3.575; Control group-37.121±3.991P<0.001),激活速率明显减小(Drug group2.578±1.075, Control group0.303±0.101P<0.001)，给予不同预刺激电压时半数失活电压明显减小(Drug group-32.740±6.916; Controlgroup-46.366±11.625P<0.01),快速失活后恢复速度明显减慢(Drug group18.279±6.706; Control group4.066±1.422P<0.001)，长时间刺激时进入缓慢失活状态钠通道比例明显增加(Drug group0.475±0.179; Control group0.709±0.154P<0.01)，给予不同预刺激时通道进入缓慢失活状态比例明显增加(-70-+20mV P<0.05)，电压门控钠通道从缓慢失活状态恢复速度明显减慢(4s, P<0.01;7s, P<0.05;10s, P<0.05)。小结:1.DMC通过改变激活，快速失活和缓慢失活性质降低了表达突变或野生TDP-43神经元电压门控钠通道的活性。2.TDP-43蛋白异常堆积可能是电压门控钠通道活性改变的主要原因。3.DMC可能是一个治疗TDP-43相关蛋白变性疾病的候选药物。