本室研究证实：骨癌痛大鼠脊髓神经元分泌趋化因子Fractalkine（FKN）作用于小胶质细胞上的CX3CR1，使其激活致痛敏。最新研究表明：在神经病理性痛状态下，趋化因子MCP-1（Monocyte chemoattractant protein-1，CCL2，单核细胞趋化蛋白-1）及其受体CCR2介导神经元和胶质细胞间的对话；并可调节外周血单核细胞Fractalkine/CX3CR1的表达和功能；但在骨癌痛（与神经病理性痛性质相似而又有其特征）中无类似报道。据此推测：脊髓MCP-1/CCR2激活小胶质细胞调控Fractalkine/CX3CR1间的信息传递，参与骨癌痛敏的发生和维持。本研究采用行为学、RT-PCR、Western-Blot、ELISA、免疫组化等方法，在分子（CCR2、CX3CR1受体）、细胞（小胶质细胞和神经元）和整体（免疫和感觉系统）水平探讨骨癌痛的神经免疫机制。为开发以神经-免疫-炎症网络为靶点的癌痛治疗药物提供新思路。第一部分趋化因子MCP-1/CCR2信号系统在大鼠骨癌痛中的作用及机制目的探讨单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1/CCL2）及其受体CCR2信号系统在大鼠骨癌痛中的作用及机制。方法采用Walker256乳腺癌细胞，注射在胫骨上端建立骨癌痛模型。雌性SD大鼠，根据研究目的进行相应的实验分组，并通过疼痛行为学（n=12）、Real-time PCR（n=4）、Western-Blot（n=4）、免疫组织化学（n=4）和ELISA（n=4）方法进行以下研究：1、观察骨癌痛大鼠脊髓MCP-1及其受体CCR2表达变化及分布；2、观察鞘内注射MCP-1中和抗体对骨癌痛大鼠疼痛行为学影响及脊髓CCR2、OX-42（小胶质细胞激活标志物）和细胞因子（IL-1β、TNF-α）表达变化。3、观察鞘内注射外源性MCP-1对正常大鼠机械痛阈的影响。结果骨癌痛大鼠L4～6脊髓背角MCP-1和其受体CCR2的mRNA及蛋白表达均显著增加（P<0.01），CCR2表达在脊髓背角小胶质细胞和神经元。2、建模后4～6d连续鞘内注射MCP-1中和抗体抑制骨癌痛的产生（P<0.01）；并减少了骨癌痛大鼠脊髓背角CCR2、OX-42及IL-1β、TNF-α细胞因子的表达（P<0.01）。建模后10～12d连续给予MCP-1中和抗体部分逆转了骨癌痛大鼠机械性痛觉过敏（P<0.01）。3、正常大鼠鞘内给予外源性MCP-1剂量依赖性的导致机械性痛觉过敏（P<0.01）。结论MCP-1/CCR2信号系统可能通过神经元-胶质细胞之间的对话介导了骨癌痛的产生和维持。第二部分MCP-1通过激活小胶质细胞Cathepsin S参与大鼠骨癌痛的发生目的探讨MCP-1是否通过激活小胶质细胞溶酶体半胱氨酸蛋白酶S（CathepsinS, CatS）参与大鼠骨癌痛的发生。方法采用雌性SD大鼠，建立胫骨癌痛模型，按照研究目的进行相应的实验分组，并通过疼痛行为学（n=8）、Western-Blot（n=4）和免疫组织化学（n=4）方法进行以下研究：1、观察骨癌痛大鼠脊髓CatS表达变化及分布；2、观察鞘内注射MCP-1中和抗体对骨癌痛大鼠脊髓CatS表达的影响；3、观察鞘内注射MCP-1后正常大鼠脊髓CatS表达的变化。结果骨癌痛大鼠脊髓CatS蛋白表达显著增加（P<0.01），骨癌痛大鼠CatS表达在脊髓小胶质细胞。2、MCP-1中和抗体有效缓解大鼠骨癌痛并减少了小胶质细胞CatS的表达（P<0.01）。3、鞘内给予外源性MCP-1可使脊髓小胶质CatS的表达增加（P<0.01）。结论MCP-1通过作用于脊髓小胶质细胞上CCR2受体激活小胶质细胞，小胶质细胞激活增加CatS的释放参与大鼠骨癌痛的维持。第三部分Cathepsin S介导Fractalkine分泌参与大鼠骨癌痛目的探讨Cathepsin S（CatS）是否通过介导Fractalkine（FKN）分泌参与大鼠骨癌痛的发展。方法采用雌性SD大鼠，建立胫骨癌痛模型，随机分为5组（n=10），观察建模后第10～12d连续鞘内注射CatS特异性抑制剂morpholinurea-leucinehomophenylalanine-vinyl phenyl sulfone （LHVS）对骨癌痛大鼠疼痛行为学影响，并通过免疫组化和ELISA方法检测脊髓OX-42、FKN的表达和脑脊液中FKN水平变化。结果建模后10～12d连续鞘内注射LHVS后部分逆转骨癌痛大鼠机械性痛觉过敏反应（P<0.01），并且减少脊髓OX-42的表达（P<0.01），同时大鼠脑脊液中FKN表达水平下降（P<0.01）。结论CatS通过介导FKN分泌参与大鼠骨癌痛的发展。第四部分MCP-1通过p38MAPK通路调控神经元Fractalkine分泌致大鼠骨癌痛目的探讨MCP-1是否通过p38MAPK通路调控神经元Fractalkine分泌致大鼠骨癌痛。方法采用雌性SD大鼠，建立胫骨癌痛模型，按照研究目的进行相应的实验分组，并通过疼痛行为学（n=8）、Real-time PCR（n=4）、Western-Blot（n=4）、免疫组织化学（n=4）和ELISA（n=4）方法进行以下研究：1、观察鞘内注射MCP-1中和抗体对骨癌痛大鼠脊髓p38、CX3CR1表达和脑脊液中FKN分泌的影响；2、观察鞘内注射MCP-1对正常大鼠脊髓p38、CX3CR1表达的影响；3、观察鞘内注射p38MAPK抑制剂4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfiny lphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole (SB203580)对骨癌痛大鼠疼痛行为学影响和脊髓CCR2、CX3CR1的表达及脑脊液中FKN分泌的变化。结果1、建模后10～12d鞘内连续注射MCP-1中和抗体显著减少骨癌痛大鼠脊髓p38mRNA和蛋白表达（P<0.01），及CX3CR1mRNA和蛋白表达（P<0.01）；同时明显降低了脑脊液中FKN的水平（P<0.01）。2、正常大鼠鞘内给予外源性MCP-1后明显增加p38和CX3CR1的蛋白表达水平（P<0.01）。3、骨癌痛大鼠鞘内注射SB203580明显抑制大鼠骨癌痛的产生（P<0.01）；并可明显减少骨癌痛大鼠CCR2和CX3CR1的表达（P<0.01）及脑脊液中FKN的水平（P<0.01）。结论MCP-1可能通过激活p38MAPK通路介导神经元FKN分泌，进而作用于小胶质细胞CX3CR1受体参与大鼠骨癌痛。