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克氏原螯虾(Procambarus clarkii)俗称小龙虾,是我国重要的经济虾类。目前,克氏原螯虾人工养殖业发展迅猛。克氏原螯虾人工养殖过程中,苗种来源主要是存塘亲本自繁后代或者是天然水域捕捞,优质苗种的缺乏一定程度上约束了整个产业的发展。性腺发育是甲壳动物进行有性生殖的基础,研究克氏原螯虾性腺发育的分子调控机制,将有助于了解其性腺发育过程特征。有关克氏原螯虾性腺发育机制的分子生物学研究较少,NCBI的Gen Bank序列数据库中相关基因的信息也比较匮乏。大量挖掘、获取克氏原螯虾性腺发育相关基因,具有重要的理论和实践意义。本研究结合高通量测序、RACE、q RT-PCR和Western-blot等技术对克氏原螯虾性腺发育相关基因的分子调控机制展开研究。首先对克氏原螯虾性腺转录组文库进行高通量测序,获得了大量EST序列。通过分析性腺发育相关基因pcna、fox L2和成熟促进因子(MPF)在性腺发育过程中的表达变化,对其分子调控机制进行初步探讨。筛选到了大量EST-SSR分子标记,为克氏原螯虾群体遗传结构分析、遗传连锁图谱构建和QTL定位等相关研究提供参考。主要研究结果如下:1.克氏原螯虾转录组高通量测序及分析利用454高通量测序技术,对克氏原螯虾精巢和卵巢组织文库进行分析,获得了1,134,993条高质量的原始序列,序列平均长度832 bp,总量达943.84 Mb。原始序列经聚类组装,产生了22,652个isotigs序列,平均长度为1,921 bp,其中有16,018个isotigs序列长度大于1000 bp。将拼接得到的isotig序列与公共数据库进行同源性搜索、比对和功能注释,在精巢与卵巢比较转录组文库中,共发现了3858个差异表达的isotigs序列,其中1,720个isotigs序列在卵巢中高表达,2138个isotigs序列在精巢中高表达。结合已报道的相关文献资料,鉴定、筛选出了一大批性腺发育相关的候选基因。另外,基于测序产生的大量EST序列筛查到数量众多的分子标记位点。本研究中构建的高质量的克氏原螯虾转录组文库,可为后续开展克氏原螯虾性腺发育相关的功能基因研究和分子遗传育种等提供重要参考。2.克氏原螯虾EST-SSR分布特征及引物的开发利用基于克氏原螯虾转录组文库高通量测序产生的22,652个EST序列,检索到6,724个SSRs位点,平均140 kb序列中出现一个SSR位点。其中二碱基复类型最多,大约占57.56%,且以AC碱基重复类型最为丰富。随机挑选100个EST-SSR位点设计引物进行PCR扩增,其中55对引物可扩增出清晰的目的条带,进一步验证发现有26对引物具有多态性,占可扩增出产物引物的47%。用克氏原螯虾盱眙群体检测其中8对引物的多态性,发现8对引物的等位基因数(NA)介于3~11之间;观测杂合度(HO)介于0.333~0.708之间;期望杂合度(HE)介于0.325~0.806之间;8对微卫星引物中有7对显示出较高的多态信息含量(PIC>0.5)。本研究中筛选的多态性微卫星标记可用于克氏原螯虾群体遗传结构分析、遗传连锁图谱构建和QTL定位等相关研究。3.克氏原螯虾不同组织及发育时期内参基因的稳定性评价选取8个甲壳动物中常用内参基因ACTB、GAPDH、EF-1α、UB、TUB、TBP、EIF和18S,分析其在克氏原螯虾组织分布组(眼柄、鳃、肝胰腺、心脏、肠、肌肉、精巢、卵巢)和卵巢发育组(未发育期、发育早期、卵黄发生前期、卵黄发生期、成熟期、产卵后期)中的表达水平,并结合常用的统计方法ge Norm、Best Keeper和Norm Finder对这些内参基因的表达稳定性做出评价。结果显示,EIF与18S在克氏原螯虾不同组织中的表达稳定性最高,TBP和EIF在克氏原螯虾卵巢发育不同时期中的表达稳定性最高,EF-1α和UB在克氏原螯虾不同组织及卵巢发育不同时期的表达稳定性均较差。本研究的结果可以为克氏原螯虾及其他甲壳动物相关基因定量研究中内参基因的选择提供参考。4.克氏原螯虾性腺发育相关基因的克隆与表达分析从克氏原螯虾卵巢组织中成功克隆了pcna、fox L2、cyclin B和cdc2基因c DNA序列全长,分别为:1387 bp、1771 bp、2589 bp和1620 bp,开放阅读框分别编码260个、339个、402个和299个氨基酸。克氏原螯虾pcna基因具有真核生物pcna基因特有的3个保守功能结构域,与中国对虾的同源性高达93%。荧光定量和Western blot结果显示,在卵巢中的表达量显著高于其他组织,且在卵巢发育早期卵母细胞大量增殖时的表达量最高,暗示其在克氏原螯虾卵细胞增殖过程起重要作用,可通过测定其表达量的增加与否来推断卵巢是否进入发育期;克氏原螯虾fox L2基因具有FOX家族特有的保守叉头框区域,3个α螺旋和2个β链形成的翼状结构,N端的氨基酸序列相对不保守,C端有一个细胞核定位信号。定量结果显示,fox L2基因在主要在克氏原螯虾的卵巢中表达,而在其他组织中表达量较低。且在卵黄发生期达到最高,表达量显著高于其他时期,推测fox L2基因在克氏原螯虾卵巢发育过程中有重要作用,可能参与了卵黄的形成过程;克氏原螯虾cyclin B基因具有周期蛋白特有的破坏框、周期蛋白盒和AMP依赖磷酸化位点,克氏原螯虾cdc2基因具有蛋白激酶特有的GXGXXGXV、PSTAIRE和DFG结构域。定量结果显示,cyclin B和cdc2基因表达特征相似,均表现出在卵巢中高表达,在精巢或者其他组织中的表达量较低。在卵巢发育过程中,主要在卵巢发育早期和成熟期有较高的表达,推测cyclin B和cdc2在克氏原螯虾卵巢发育和卵子发生过程起重要作用,包括卵巢发育早期的卵原细胞增殖过程及卵巢成熟期的减数分裂过。