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背景与目的重症肌无力（myasthynia gravis,MG）是一种典型的自身免疫病,大多数患者由于机体产生针对乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor,AchR）的自身抗体,封闭了乙酰胆碱与AchR在神经肌肉接头处的结合,从而阻断神经-肌肉信号的传递,导致肌肉收缩无力。IL-17是一种炎症调节性细胞因子,密切参与自身免疫病的发生、发展过程。γδT17细胞不仅是IL-17的重要来源,而且还可以促进Th17细胞产生IL-17。因而近年来,γδT17在感染及自身免疫病的发病过程中的作用越来越受到人们的重视,但γδT17与MG的关系还不甚明了。我们前期通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测到MG患者胸腺γδT细胞数量增多;并且免疫荧光标记结果显示,S1P1阳性γδT细胞多分布于皮髓交界处（corticomedullary junction,CMJ）,S1P1是介导γδT细胞胸腺迁出和炎症迁移的重要分子,提示MG患者胸腺存在γδT细胞输出增多的现象。为进一步分析MG病理条件下γδT17细胞胸腺迁出和炎症趋化的特性,本实验用重组人AChRα亚基的97-118肽段免疫Lewis大鼠,建立实验性自身免疫重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG）模型,通过检测γδT17细胞S1P1与CCR9等炎症趋化受体的表达,分析EAMG鼠γδT17细胞的炎症趋化特性及S1P1受体信号对γδT活化和功能的影响。方法1.Lewis大鼠EAMG的建立及评价:使用重组人AChRα亚基97-118肽段免疫Lewis大鼠建立EAMG模型。将42只大鼠随机分为两组,其中22只为EAMG诱导组,20只为对照组,按照200μg/只,每28天在其双后肢足垫及双肩部皮内注射肽段,共免疫三次,首次诱导免疫使用完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA）,之后采用不完全弗氏佐剂（incomplete Freund’s adjuvant,IFA）。免疫开始后,每7天测量一次大鼠体重,并进行抓笼实验检测肌肉功能。在免疫前和第二次、第三次免疫后第15天,抽取大鼠尾静脉外周血,ELISA检测血清中抗AChRα抗体的滴度,若EAMG诱导组血清OD值/对照组血清OD值≧2.1则视为抗体阳性。第三次免疫15天后,对大鼠进行肌电图检测,分别记录EAMG诱导组和对照组动作电位,并计算第4波与第1波振幅之比。3Hz和5Hz刺激平均波幅下降10%以上视为低频重复神经电刺激波幅递减异常,即阳性。最后结合EAMG大鼠评分细则对大鼠进行建模结果评分。2.γδT17细胞S1P1及趋化因子受体表达的检测:通过无菌操作手术分离、摘取EAMG组和对照组大鼠胸腺及腋窝、腹股沟淋巴结,经研磨过滤制成单细胞悬液。用抗CD3-FITC、γδTCR-PE、IL-17-APC、S1P1-Alexa Fluor 680、CCR2-Alexa Fluor 700、CCR6-Alexa Fluor 405和CCR9-Alexa Fluor 700荧光标记抗体及同型对照抗体标记细胞,FCM检测γδT及γδT17细胞比例,并分析γδT和γδT17细胞表面S1P1和相应趋化因子受体的表达。3.标记EAMG大鼠胸腺和淋巴结组织S1P1+γδT细胞的分布:制备大鼠淋巴结及胸腺组织石蜡切片进行免疫组化染色,观察γδT细胞的分布;利用抗γδTCR和抗S1P1抗体对大鼠淋巴结和胸腺组织冰冻切片进行免疫荧光染色,观察S1P1+γδT细胞的分布。4.检测分析S1P1受体信号对γδT细胞分泌炎症细胞因子的影响:无菌分离获取Lewis大鼠脾脏单个细胞悬液,于37℃,5%CO2条件下培养1h 40min,留取贴壁基质细胞。免疫磁珠分选大鼠淋巴结中γδT细胞,流式鉴定阳性率>90%。按照基质细胞与γδT细胞数目之比为1:1建立混合培养体系,加入IL-2（2000UI/mL）和抗CD3抗体（50μg/105个细胞）。使用S1P（1μM）对S1P1信号进行刺激,将混合培养的细胞分为四组,EAMG组Blank、EAMG-S1P刺激组、对照组Blank和对照-S1P刺激组;36h后流式抗体标记EAMG组γδT表面CCR2和CCR6,并提取各组细胞总蛋白,使用Biolegend公司LEGENDplexTM Multi-Analyte Flow试剂盒FCM检测所提取各组总蛋白中IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-17F、IL-22、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的浓度。5.统计学分析:利用SPSS 20.0统计学软件进行正态性检验,若数据符合正态性分布,采用t检验分析,若数据不符合则采用ANOVA分析,结果以均数±标准差表示,P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.Lewis大鼠EAMG建模评价结果:EAMG诱导组体重逐渐下降,且有力抓笼次数也出现降低;ELISA检测结果显示,第二次,第三次诱导免疫后15天,EAMG诱导组血清OD值与对照组血清OD值之比分别为3.94±0.85和7.72±1.65,即EAMG诱导组外周血中抗重组AChRα亚基97-118肽段抗体呈阳性;肌电图结果显示,除去4只阴性大鼠外,EAMG诱导组低频重复神经电刺激3Hz和5Hz波幅衰减率分别为15.90±4.30%、15.60±3.65%,和对照组（6.60±3.20%、8.70±2.30%）相比差异具有统计学意义（P<0.05）。至免疫结束,EAMG诱导组22只大鼠评分结果为,0分4只,1分2只,2分12只,3分4只,4分0只;对照组评分全部为0分。2.γδT细胞在EAMG大鼠淋巴结和胸腺中的表达与分布:FCM结果显示,EAMG组大鼠淋巴结（1.22±0.12%）和胸腺中（0.43±0.11%）CD3+γδT细胞均高于对照组淋巴结（0.84±0.16%）和胸腺（0.22±0.07%,P<0.05）。胸腺组织中,γδT细胞多位于被膜下区、CMJ及髓质区;EAMG组S1P1+γδT在胸腺血管丰富的CMJ处明显增多,S1P1highγδT细胞比例（54.33±18.41%）显著高于对照组（5.72±1.45%,P<0.05）。而淋巴结中,γδT细胞多分布于髓质,且EAMG组髓质区S1P1+γδT较对照组明显增多,S1P1highγδT在EAMG组淋巴结细胞中的比例（38.99±10.09%）也明显高于对照组（13.68±3.39%,P<0.05）。以上数据提示EAMG组γδT细胞胸腺输出和淋巴迁出均增多。3.EAMG大鼠胸腺中γδT17细胞S1P1与炎症趋化因子受体的表达:FCM结果显示,EAMG组γδT17在γδT细胞中比例为12.25±2.79%,显著高于对照组（5.81±1.52%,P<0.05）;在γδT17细胞中,EAMG组S1P1阳性率（97.34±1.83%）与对照组（95.87±2.07%）相比无明显差异（P>0.05）,但γδT17细胞S1P1平均荧光强度（377.5±89.90）却显著高于对照组（250.17±21.62,P<0.05）,提示EAMG胸腺γδT17细胞S1P1表达上调。另外EAMG组γδT17细胞中,S1P1/CCR9双阳性细胞比例为85.08±4.19%,较对照组（64.97±6.12%）明显增多（P<0.05）,且CCR6+γδT17细胞比例（29.69±6.31%）也显著高于对照组（15.33±3.60%,P<0.05）,提示EAMG鼠从胸腺归巢的γδT17细胞增多。4.EAMG大鼠淋巴结中γδT17细胞表面S1P1与炎症趋化因子受体的表达:FCM结果表明,EAMG组γδT17在γδT细胞中比例为14.58±2.92%,显著高于对照组（6.13±1.92%,P<0.05）;γδT17细胞S1P1+细胞比例（97.44±2.61%）较对照组（82.66±6.55%）明显增高（P<0.05）,CCR2+、S1P1/CCR9双阳性细胞比例分别为70.18±7.49%、84.68±9.59%,显著高于对照组（40.42±5.18%、54.21±7.83%）（P<0.05）,而CCR6+细胞比例（32.93±4.96%）较对照组（47.54±6.42%）则明显降低（P<0.05）。5.S1P1信号对γδT细胞功能的影响:在S1P的刺激下,EAMG组和对照组IL-2、IL-6、TNF-α、GM-CSF、IL-17A和IL-17F的浓度较各自空白组明显增高（P<0.05）;但IFN-γ、IL-22、IL-13、IL-10、IL-9、IL-5和IL-4的表达无明显差异（P>0.05）。另外,FCM检测发现EAMG-S1P刺激组CCR2+γδT细胞比例（47.90±7.84%）明显高于其未刺激组（2.38±1.84%,P<0.05）。结论EAMG Lewis大鼠胸腺和淋巴结中γδT17细胞比例增加,且S1P1和炎症趋化因子CCR9的表达均上调,淋巴结中γδT17表面CCR2上调,提示EAMG鼠γδT17从胸腺和淋巴结的输出增多。体外实验表明,S1P1受体信号可促进γδT细胞CCR2表达上调、并刺激IL-17等细胞因子的分泌,促进γδT的炎症调节功能。