【摘 要】
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胸腺是重要的中枢淋巴器官,是T淋巴细胞分化、发育和成熟的重要场所,在机体免疫系统中具有极其重要的作用。胸腺随着年龄的不同变化很大,性成熟时体积和重量达到最大,随后逐渐退化萎缩,脂肪组织相对增加,最后几乎被脂肪组织代替。胸腺主要由胸腺细胞和胸腺基质细胞组成。胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells,TECs）是最为重要的胸腺基质细胞。TECs是构成胸腺细胞发育、分化和成熟所必须的
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31572475）；
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胸腺是重要的中枢淋巴器官,是T淋巴细胞分化、发育和成熟的重要场所,在机体免疫系统中具有极其重要的作用。胸腺随着年龄的不同变化很大,性成熟时体积和重量达到最大,随后逐渐退化萎缩,脂肪组织相对增加,最后几乎被脂肪组织代替。胸腺主要由胸腺细胞和胸腺基质细胞组成。胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells,TECs）是最为重要的胸腺基质细胞。TECs是构成胸腺细胞发育、分化和成熟所必须的三维网状微环境的重要组成部分。TECs的增殖能力下降会导致正常胸腺微环境破坏,是引发胸腺退化的决定性因素。然而在年龄因素占主导的胸腺退化过程中TECs增殖能力下降的分子机制尚不明确。高通量测序技术使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。有研究发现micro RNAs（miRNAs）参与了胸腺的发育与退化。miRNAs是一类长度约为22 nt左右的非编码RNA,随着研究的深入,越来越多的miRNAs被发现与细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢、肿瘤发生等方面的调控有关。miRNAs对TECs具有重要的调控作用,而与年龄相关的miRNAs对TECs的影响及其分子机制有待深入研究。本研究基于实验室以往高通量测序结果分析,从不同年龄的小鼠胸腺和TECs测序结果中筛选出与年龄相关的差异上调的miRNAs共54个,选取其中一个miR-152-3p。以小鼠髓质胸腺上皮细胞系（medullary thymic epithelial cell line 1,MTEC1）细胞为研究对象,通过CCK-8法、Ed U掺入法、流式细胞术、实时荧光定量PCR、双荧光素酶报告基因实验、Western blot等技术,从细胞活力、细胞增殖、细胞周期等方面来探究该miRNA对胸腺上皮细胞增殖的影响。通过CCK-8法检测细胞活力可知,miR-152-3p对MTEC1细胞呈现抑制作用,过表达miR-152-3p能抑制MTEC1细胞活力（P＜0.001）;反之,抑制miR-152-3p,MTEC1细胞活力上升（P＜0.01）。而流式细胞术结果显示,过表达miR-152-3p会使得MTEC1细胞G1期数量增多（P＜0.01）,S期减少（P＜0.01）,出现G1期阻滞,抑制增殖,而抑制miR-152-3p会导致G1期减少（P＜0.01）,S期和G2期增多（P＜0.01）,促进增殖。Ed U掺入法检测细胞增殖可见,过表达miR-152-3p能抑制MTEC1细胞增殖,而抑制miR-152-3p能够促进MTEC1细胞增殖。以上结果显示miR-152-3p抑制MTEC1细胞增殖。通过RT-PCR验证,过表达miR-152-3p能够使细胞周期相关的C-myc（P＜0.001）、Ccnd1（P＜0.001）、Ccne1（P＜0.01）和Cdk4（P＜0.01）等基因表达量下降。抑制miR-152-3p能够使C-myc（P＜0.001）、Ccnd1（P＜0.01）、Ccne1（P＜0.01）和Cdk4（P＜0.01）等基因表达量上升。通过靶基因预测软件的筛选和RT-PCR验证后可知,Smad2与miR-152-3p呈负调控关系。通过双荧光素酶报告实验,Smad2的3’UTR区域能和miR-152-3p结合,抑制其表达,表明Smad2是miR-152-3p的靶基因。通过Western blot测得SMAD2蛋白水平,与基因表达水平相一致。转染干扰片段si Smad2,Smad2的基因与蛋白表达水平明显下降。通过流式细胞术实验和RT-PCR检测,发现抑制Smad2基因表达能够抑细胞周期进程,同时抑制细胞周期相关基因的表达,与miR-152-3p结果相一致,说明miR-152-3p是通过靶基因Smad2来调控细胞增殖。结论:具有年龄差异的miR-152-3p能通过调控细胞周期相关基因来抑制胸腺上皮细胞增殖,使得G1期发生阻滞,抑制细胞增殖;Smad2是miR-152-3p的靶基因,miR-152-3p是通过靶向Smad2来调控细胞增殖。推测miR-152-3p的差异上调可能促进了胸腺退化的过程。miR-152-3p可以作为胸腺退化的生物标志物,提示了miR-152-3p可能是治疗胸腺退化的潜在靶点。总的来说,本研究为分子水平深入揭示和研究胸腺退化的年龄差异提供了重要的实验依据。
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